Zmiany specyficzne dla kłębuszków ekspresji VEGF-A prowadzą do wyraźnych wrodzonych i nabytych chorób nerek cd

Mocz pobrano biernie w probówce Eppendorfa od myszy 0, 3, 6 i 9-tygodniowych. Do oznaczenia obecności lub braku białka i czerwonych krwinek w moczu wykorzystano prętowy wskaźnik moczu (Chemstrip 5L, Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, Indiana, USA). Standardowy test kolorymetryczny przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Dodatkowo, 2 .l moczu od myszy transgenicznych lub kontrolnych umieszczono w 18 .l buforu Laemmli (18), gotowano i nanoszono na żel 12% SDS-PAGE. Na pierwszym pasie żelu wprowadzono białko o niskim zakresie białek SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Próbki krwi pobrano heparynizowaną rurką kapilarną przez ukłucie żyły udowej po ogrzaniu. Łącznie zebrano 120 .l krwi, a pomiary kreatyniny, mocznika i chemii krwi zarejestrowano przy użyciu Stat Profile M7 (Nova Biomedical Corp., Waltham, Massachusetts, USA). CBC (całkowita liczba krwinek) została przeprowadzona na liczniku Coulter (AcT diff; Beckman Coulter Canada, Ontario, Kanada). Analiza histologiczna. Tkanki zarodkowe do analizy histologicznej wycięto, utrwalono w 10% formalinie / PBS i zatopiono w parafinie. Wycinano przekroje o grubości 4 .m. Skrawki wybarwiono H & E, zbadano i sfotografowano aparatem Leica DC200 i mikroskopem Leica DMLB (Leica Microsystems Inc., Deerfield, Illinois, USA). Tkanki do mikroskopii elektronowej utrwalono w 1,5% aldehydem glutarowym, osadzono w Spurr (Canemco Inc., Saint-Laurent, Quebec, Kanada) i podzielono na sekcje. Hybrydyzacja in situ i immunohistochemia. Nerki zostały wycięte z myszy w dniu 0 po urodzeniu oraz w tygodniu, 3 tygodniu, 6 tygodniu lub 9 tygodniu życia. Nerki płukano krótko w PBS bez RNaz i utrwalano przez noc w 4% paraformaldehydzie traktowanym DEPC. Te tkanki następnie umieszczono w 30% sacharozie na 12. 24 godziny, zatopiono w związku Tissue-Tek OCT 4583 (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, Kalifornia, USA) i szybko zamrożono. Próbki tkanki o wielkości 10 mikronów pocięto na kriostacie Leica Jung (model CM3050, Leica Microsystems Inc.) i przeniesiono do szkiełek mikroskopowych Superfrost (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pennsylvania, USA). Preparaty przechowywano w temperaturze ~ 20 ° C do momentu użycia. Sondy znakowane digoksygeniną wytworzono zgodnie z protokołem Roche Molecular Biochemicals (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy). Sondy stosowane do analizy in situ to nefryna (19), gen supresorowy Wilmsa (WT1, dobry dar J. Kreidberg, Children s Hospital, Boston, Massachusetts, USA), podocin (miły prezent od C. Antignac, Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale, Paryż, Francja),. -Smek mięśni gładkich (VSMA, miły prezent od P. Igarashi, Southwestern University, Dallas, Texas, USA), VEGF-A (dobry prezent od A. Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Toronto, Kanada). Szczegóły protokołu analizy in situ można uzyskać na żądanie. Immunobarwienie przeprowadzono z użyciem przeciwciał przeciwko WT1 i PECAM, jak opisano (20). Wyniki Myszy, które są heterozygotyczne pod względem VEGF-A w podocytach, rozwijają śródbłonek i zespół nerczycowy. Aby określić, czy istnieje fenotyp wynikający ze zmniejszenia dawki genu VEGF-A w podocycie, zastosowaliśmy system Cre-loxP. Myszy rekombinaze z krezki nerkowej zostały wygenerowane w naszym laboratorium i są zdolne do specyficznej miejscowo rekombinacji w 100% podocytów w stadium pętli kapilarnej in vivo (17). Wytworzyliśmy myszy, które były heterozygotyczne pod względem allelu VEGF-A z flox i nosiliśmy transgen Nefryn-Cre VEGF-loxP + / a, Neph-Cre + /. (Ryc. 1, c i d). Urodzili się na oczekiwanej częstotliwości mendlowskiej, ale rozwinęli schyłkową niewydolność nerek o 9-12 tygodni. Fizyczne badanie myszy na tym etapie wykazało, że 30/30 VEGF-loxP + / a, Neph-Cre + /. myszy miały letarg i zmniejszyły przekrwienie skóry. Przeprowadzono analizę moczu i wykazano 3,0 g / l białka (określanego jako. Zespół nerczycowy. Białkomocz) i 250 czerwonych krwinek /. L moczu metodą analizy wskaźnika. Analiza SDS-PAGE wykazała masywną albuminurię we wszystkich tych VEGF-loxP + / p, Neph-Cre + / r. myszy (Figura 2a), które są patognomiczne pod względem uszkodzenia bariery filtracyjnej. Chemia krwi wykazała, że myszy mają znacznie zmniejszoną czynność nerek z podwyższonym poziomem kreatyniny w surowicy, który mierzy 200 .M, ponad dziesięć razy więcej niż wartość normalna, znacznie podwyższony mocznik i normochromową anemię normocytową, odpowiadającą schyłkowej niewydolności nerek (Figura 2b). . Należy zauważyć, że fragmentacja krwinek czerwonych nie została zaobserwowana na rozmazie krwi. Myszy nie wykazały żadnych poważnych objawów niewydolności nerek przed 7. 8 tygodniem życia. Figura 2 heterozygotyczny VEGF-loxP + / a, Neph-Cre + /. u myszy wystąpił zespół nerczycowy i schyłkowa niewydolność nerek w wieku 9 tygodni
[hasła pokrewne: sanatorium krystyna busko, toksyczni rodzice chomikuj, beata rusin komornik ]
[więcej w: engerix b cena, remigiusz wierzgoń wikipedia, odziejsie ]