Zmiany specyficzne dla kłębuszków ekspresji VEGF-A prowadzą do wyraźnych wrodzonych i nabytych chorób nerek ad

Sugeruje to, że VEGF odgrywa rolę w utrzymywaniu bariery filtracyjnej przez przeżycie, proliferację i / lub wskaźniki różnicowania do sąsiedniej wyspecjalizowanej endoteliny. Jest oczywiste, że VEGF jest krytycznym mediatorem dla waskulogenezy, ponieważ heterozygotyczne i homozygotyczne myszy VEGF-A zanikają z dużymi wadami naczyniowymi odpowiednio po 11,5 i 9,5 dniach po stosunku (11, 12). Jednak późniejsza rola w określonych łożyskach naczyniowych, takich jak kłębuszek nerkowy, jest mniej wyraźna. Chociaż rozregulowanie ekspresji VEGF-A wykazano w wielu chorobach nerek, znaczenie tych zmian jest obecnie nieznane. Aby określić rolę VEGF-A w barierze filtracyjnej kłębuszkowej, wygenerowaliśmy myszy z uzyskaniem lub utratą funkcji VEGF specyficznie w podocytach, unikając w ten sposób efektów zarodkowych śmiercionośnych. Wyraźne fenotypy specyficzne dla kłębuszków i fenotypy zerowe obserwowane w tym badaniu pokazują po raz pierwszy, że dawka a. VEGF ma krytyczne znaczenie w ustanawianiu i utrzymaniu późniejszych łożysk naczyniowych, ponieważ ma ono kształt naczyń krwionośnych podczas wcześniejszych stadiów embriogenezy. W wieku 2,5 tygodnia myszy z heterozygotycznością specyficzną dla podocyt dla VEGF rozwinęły śródbłonek i. Krwotoczne kłębuszki. uszkodzenie nerek obserwowane w stanie przedrzucawkowym, które uległo progresji do zespołu nerczycowego, powszechnego zespołu kłębuszkowego obserwowanego u ludzi (13) i schyłkowej niewydolności nerek o 9-12 tygodni. Homozygoty specyficzne dla podocytów zmarły w momencie urodzenia lub w ciągu 18 godzin od urodzenia z powodu obrzęków (uogólniony obrzęk), niewydolności nerek i rażąco nieprawidłowych kłębuszków, które nie mają dojrzałych komórek śródbłonka. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja izoformy 164 VEGF-A w podocytach doprowadziła również do końcowej niewydolności nerek ze względu na zapadającą się kłębuszkowatość, która jest zmianą patologiczną obserwowaną w nefropatii związanej z HIV (HIVAN) (14). To pokazuje, że istnieje ciągły wymóg ścisłej regulacji sygnalizacji VEGF między podocytem a śródbłonkiem kłębuszkowym; zakłócenie w tej regulacji prowadzi do dramatycznych i wyraźnych fenotypów nerkowych, które są określone przez kłębuszkową dawkę VEGF i sugeruje, że VEGF ma decydujące znaczenie w wielu różnych chorobach nerek. Metody Celowanie genetyczne specyficzne dla komórek. Trzy niezależne specyficzne dla podocytu linie mysiej rekombinazy Cre, A15, GG8 i V9, które wszystkie wykazały 100% wycięcie przy krzyżowaniu ze szczepem myszy reporterowej Z / EG (15), zostały wyhodowane na floodzie myszy VEGF-A (Figura 1c) . Mysz VEGF-A ma miejsca loxP wstawione wokół trzeciego eksonu (16). Miejscowa rekombinacja między miejscami loxP genu VEGF skutkuje zerowym allelem VEGF (16). W celu wytworzenia homozygotycznych, spłaszczonych myszy VEGFa, rekombinazę Cre, myszy transgeniczne niosące zarówno transgen nefryny-Cre, jak i jeden allel VEGF-A flox były hodowane do homozygotycznych, spłaszczonych myszy VEGF-A. Aby wytworzyć transgeniczne czynniki tworzące, które nadeksprymują izoformę 164 VEGF-A, fragment 645-bp genu VEGF, zawierający sekwencję konsensusową Kozak (nukleotydy 78. 669 z numeru dostępu GenBank nr NM009505) i inicjującą ATG, subklonowano do XhoI. i miejsca XbaI wektora pNXRS między 4,125 kb 5. fragment mysiego genu nefryny, który jest zdolny do ekspresji specyficznej dla podocytów in vivo w nerce (17) i sygnału poli (A) 0,97 kb z wirusa poliomy SV40 (Figura 1e). Genotypowanie. Genomowy DNA wyizolowano z ogonów myszy zgodnie z opisem. Myszy transgeniczne nefryny-Cre wytworzono i genotypowano, jak opisano uprzednio (17). Myszy VEGF z flox otrzymano od Napoleone Ferrara (Genentech Inc.). Obecność zmutowanego genu VEGF wykrywano za pomocą PCR przy użyciu starterów oligonukleotydowych muVEGF 419.F (5a-CCTGGCCCTCAAGTACACCTT-3a) i muVEGF 567.R (5a -TCCGTACGACGCATTTCTAG-3 (3) (oba z Sigma-Genosys, The Woodlands Texas, USA), które generują fragment allelu VEGF o wielkości 148 par zasad w obecności miejsca loxP-1 i fragmentu DNA, który jest o około 40 bp krótszy niż dla allelu typu dzikiego (16). Aby zidentyfikować założycielskie linie myszy, które niosły transgen nefryny-VEGF-164, przeprowadzono analizę Southern blot. Pokrótce, DNA trawiono EcoRI; użytą sondą był fragment o długości 645 bp, kodujący cDNA VEGF-164, który rozpoznał genomowy fragment 1,3-kb w transgenicznych założycielach. Aby oszacować liczbę kopii transgenu, .g, 2 .g i 5 .g genomowego DNA od transgenicznego założyciela lub myszy typu dzikiego przeniesiono na membranę Biodyne B (P / N 60207, Pall Gelman Laboratory, Ann Arbor, Michigan USA) i hybrydyzuje się z sondą cDNA VEGF opisaną powyżej. Sygnał oznaczano ilościowo przy użyciu oprogramowania ilościowego Quantity One (wersja 4.2.1) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Analiza fenotypowa
[podobne: protruzja krążka międzykręgowego, mazak gostyń, klinika bocian białystok ]
[przypisy: hydrokolonoterapia poznań, hydrokolonoterapia wrocław, raven market ]