Zakłócenie ECE-1 i ECE-2 ujawnia rolę enzymu konwertującego endotelinę-2 w mysim rozwoju serca czesc 4

Zwłaszcza ekspresję ECE-2 obserwowano również w małych ilościach w sercu. MRNA ECE-1 był silnie eksprymowany w różnych tkankach, w tym w płucach, wątrobie, nadnerczach, nerkach, drogach trawiennych, najądrzu, jądrach i mięśniach szkieletowych. Chociaż ekspresję mRNA ECE-1 obserwowano w prawie wszystkich badanych tkankach, ekspresja ECE-2 wykazała wysoce ograniczony wzorzec dystrybucji. W mózgu dorosłego, w którym obfita wiadomość została wykryta za pomocą analizy Northern, mRNA ECE-2 ulegał ekspresji w heterogenicznych populacjach neuronów na dużych obszarach obejmujących wzgórze, podwzgórze, jądro migdałowate, zakręt zębaty i CA3 (dane nie pokazane). Figura 1. Analiza Northern blot mRNA ECE-1 (górny panel) i mRNA ECE-2 (środkowy panel) w dojrzałych tkankach myszy. Rehybrydyzacja z sondą GAPDH jest pokazana jako wewnętrzna kontrola ilości załadowanego RNA (dolny panel). Groty strzałek pokazują specyficzne sygnały dla mRNA ECE-1 i ECE-2. Ekspresja mRNA ECE-2 w mózgu embrionalnym i poduszce wsierdzia. W zarodkach E10.5 wykryto słabą i rozproszoną ekspresję mRNA ECE-2 w mezenchymie zarodków i części rdzenia nerwowego (dane nie pokazane). Ogólna ekspresja mRNA ECE-2 pozostawała słaba aż do E12.5, z tym wyjątkiem, że warstwy niezróżnicowanych neuronów ruchowych były pozytywne dla ekspresji ECE-2 (dane nie pokazane). W E13.5 wykryto skupione sygnały w przedniej części rurki nerwowej, zwojach korzonków grzbietowych i obustronnym tułowiu sympatycznym (Figura 2a). W rozwijającym się sercu wykryto mRNA ECE-2 w poduszce wsierdzia (Figura 2b). Endokardium i mięsień sercowy właściwy serca były negatywne pod względem ekspresji mRNA ECE-2. Ponadto, mezenchymalnie mezenchymu w okrężnicy i mezenchauzie okołobronkowej wyrażono niski poziom mRNA ECE-2 (danych nie pokazano). Analiza RT-PCR potwierdziła, że transkrypt ECE-2 był wykrywalny w sercu embrionalnym mysim E12.5 i E13,5 (Figura 2d). Figura 2Detekcja transkryptów ECE-2 w zarodkach myszy typu dzikiego za pomocą analizy hybrydyzacji in situ (a, b i c) i RT-PCR (d). (a) Przekrój poprzeczny zarodków myszy E13.5 typu dzikiego wykazujących silną ekspresję ECE-2 w przedniej części rurki nerwowej (nt), zwojach korzeni grzbietowych (DRG) i obustronnym tułowiu sympatycznym (sym). RA, prawe przedsionek; LA, lewe przedsionek; RV, prawa komora; LV, lewa komora. (b) Większe powiększenie a, przedstawiające serce. Należy zauważyć, że ekspresja ECE-2 (strzałki) jest wykrywana w mezenchymie poduszki wsierdzia (ecc). (c) Sonda sensowna nie pokazała żadnego sygnału dodatniego. (d) Ekspresję ECE-2 można wykryć za pomocą RT-PCR w sercach myszy E12.5 i E13.5. Wytwarzanie myszy zerowych ECE-2. ECE-2 jest metaloproteazą związaną z błoną i ma 59% identyczności aminokwasów z ECE-1 (11). Domena katalityczna wiążąca cynk na COOH-końcu jest niezbędna dla aktywności enzymatycznej zarówno dla ECE-1, jak i ECE-2. Pokazano w zarodkach zerowych ECE-1, że rozerwanie tej domeny wiążącej cynk może całkowicie znieść aktywność enzymatyczną (12). Aby inaktywować mysi gen ECE-2 in vivo, ekson kodujący analogiczny motyw wiążący cynk został zastąpiony przez nową kasetę przez homologiczną rekombinację w komórkach ES (Figura 3a). Zidentyfikowano osiem rekombinowanych klonów komórek ES i trzy klony wstrzyknięto do blastocyst otrzymanych od samic C57BL6 / J. Trzy chimeryczne samce z dwóch niezależnych klonów komórek ES dały transmisję linii zarodkowej. Myszy F1 heterozygot były zdrowe i płodne i krzyżowały się w celu uzyskania homozygotycznego ECE-2 (3 /. myszy (Figura 3b). Genotypowanie 21 dnia po urodzeniu myszy wykazało mendlowskie dziedzictwo, co sugeruje, że nie było śmiertelności embrionalnej ani noworodkowej w ECE-2. /. myszy. Zarówno kobieta jak i mężczyzna ECE-2. /. myszy były żyzne i zdrowe i nieodróżnialne od miotów typu dzikiego w ich szybkościach wzrostu. Żywotność ECE-2. /. myszy były nie do odróżnienia od myszy typu dzikiego i ECE-2 + /. myszy. Nie było żadnych wulgarnych neurologicznych lub behawioralnych nieprawidłowości, które sugerowałyby jakiekolwiek wady w ośrodkowym układzie nerwowym. Histologiczne badania różnych tkanek, w tym mózgu, przysadki, rdzenia kręgowego, serca, płuc, wątroby, pęcherzyka żółciowego, żołądka, dwunastnicy, jelita czczego, jelita krętego, okrężnicy, trzustki, śledziony, nerek, nadnerczy, jajnika, macicy, jąder, pęcherza, aorta, mięśnie szkieletowe i tkanka tłuszczowa nie wykazały żadnych nieprawidłowości w ECE-2. /. myszy. RT-PCR wykonano przy użyciu całkowitego RNA wyekstrahowanego z mózgu dorosłego ECE-2 + / +, ECE-2 + / a, i ECE-2 (3/3; myszy. Pasmo 160 pz odpowiadające odwrotnie transkrybowanemu cDNA ECE-2 wykryto w dzikim typie i ECE-2 + / p. myszy, ale nie w ECE-2. /. myszy (Figura 3c). Bez RT nie wykryto sygnału we wszystkich ścieżkach. Przeciwnie, 91 pz fragmentu cDNA p-aktyny wykryto w każdym genotypie (Figura 3c), i nie wykryto tego bez reakcji RT (dane nie pokazane)
[podobne: wyparzanie słoików w piekarniku, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, toksyczni rodzice chomikuj ]
[więcej w: duszacy kaszel, mazak gostyń, protruzja krążka ]