Zakłócenie ECE-1 i ECE-2 ujawnia rolę enzymu konwertującego endotelinę-2 w mysim rozwoju serca cd

W przypadku analizy Southern blot, 10 .g genomowego DNA trawiono BamHI i sondowano przy użyciu 3 .l. zewnętrzną sondę lub strawiono EcoRI i hybrydyzowano z neorową sondą (patrz Figura 3a). Analiza Northern blot. RNA ekstrahowano z dojrzałych mysich tkanek przy użyciu RNA STAT-60 (TEL-TEST. B. Inc., Friendswood, Texas, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Całkowity RNA (15 .g) został denaturowany w M dejonizowanego glioksalu / 50% dimetylosulfotlenku / 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,0) i rozdzielony w 1,2% żelu agarozowym. Błony przenoszone przez RNA poddano prehybrydyzacji i hybrydyzacji, jak opisano wcześniej (14). W przypadku sond, częściowe cDNA dla mysiego ECE-1 i ECE-2 uzyskano przez przeszukiwanie biblioteki cDNA mysiego mózgu przy użyciu produktu RT-PCR o 110 bp i produktu RT-PCR o 92 bp, odpowiednio, jako sondy (11). Fragment EcoRI o wielkości 1,1 kb zawierający 5. kodujący region cDNA ECE-1 i fragment EcoRI-PstI o długości 1,2 kb zawierający 5. region kodujący cDNA ECE-2 był losowo zagruntowany znakowany 32P i stosowany jako sondy. Analiza RT-PCR. Całkowity RNA wyekstrahowano z mózgu dorosłego ECE-2 + / +, ECE-2 + / a, i ECE-2 P / l. myszy i zarodka embrionu w wieku embrionalnym (E) 12,5 i E13.5. Cewkę pierwszej nici zsyntetyzowano z .g całkowitego RNA przy użyciu SuperScript II RT (Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA) ze starterami oligo (dT), zgodnie z zaleceniami producenta. W celu traktowania DNA dla DNazy I, każdy RNA traktowano DNazą I wolną od 10N RNazy przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed syntezą pierwszej nici. Następnie przeprowadzono PCR na próbkach cDNA za pomocą swoistych starterów 5a-CCCGTGAACGCTTACTACCTT-3. i 5 (3-GGTCATCAAAGGCATGTGTCA-3a, które zamplifikowało 160-bp cDNA ECE-2 i 280-bp genomowego DNA ECE-2. Trzydzieści cykli (30 sekund w 94 ° C, minuta w 60 ° C i 3 minuty w 72 ° C) zastosowano do RT-PCR cDNA ECE-2. Jako kontrola wewnętrzna, primery 5. -GGATCCGGTCGTACCACAGGCATTGTGATG-3. i 5. -GAATTCGGAGAGCATAGCCCTCGTAGATGG-3. użyto do amplifikacji fragmentu cDNA p-cDNA o wielkości 91 pz w tym samym stanie, co właśnie opisano. Generacja zarodków podwójnie homozygotycznych pod względem zmutowanych alleli ECE-1 i ECE-2. Homozygotyczny ECE-2. /. mężczyźni na hybrydowym tle hybrydowym C57BL6 / J-129 / SvEv byli połączeni z ECE-1 + /. heterozygotyczne samice. Uzyskane podwójne heterozygotyczne samice ponownie skojarzono z ECE-2 (3 / l. homozygotyczni mężczyźni wytwarzający ECE-1 + / y; ECE-2. /. myszy. Te myszy następnie skrzyżowano w celu otrzymania zarodków, które były ECE-2 (3 (3). i typu dzikiego, heterozygotycznego lub homozygotycznego pod względem przerywanego allelu ECE-1. Ranek, w którym znaleziono korek pochwy, oznaczono jako E0,5, a ciężarne samice uśmiercano przez inhalację CO2 w wyznaczonym dniu ciąży. Przeprowadzono również heterozygotyczne krzyżówki ECE-1 w celu otrzymania zarodków typu dzikiego, ECE-1 + / a lub ECE-1 P3 / p. Przeprowadzono również heterozygotyczne krzyżówki ECE-1 w celu uzyskania zarodków typu dzikiego, ECE-1 + / a lub ECE-1 (3/3. Mieszkańcy tego miotu byli wykorzystywani jako kontrole w trakcie niniejszego badania. Oznaczanie tkankowych peptydów ET. Całkowite zarodki E12.5 homogenizowano bezpośrednio po rozbiórce przez Polytron (Brinkmann, Littau, Szwajcaria) (20 000 rpm) w 20 x objętości M kwasu octowego zawierającego 0,01 mM pepstatyny A przez 30 sekund, a homogenaty natychmiast umieszczono we wrzący łaźnia wodna przez 10 minut. Po odwirowaniu przy 15 000 g, supernatant zatężono na kolumnach Sep-pak C18 (Varian, Harbour City, Kalifornia, USA), jak opisano poprzednio (12). Immunoreaktywny dojrzały poziom ET-1 / ET-2 określono za pomocą testu immunoenzymatycznego typu kanapkowego (EIA) (15) z syntetycznym ludzkim ET-1 jako standardem w potrójnych studzienkach. Ta dojrzała EIA ET-1 w pełni reaguje krzyżowo z mysimi ET-1 i ET-2, ale nie wykrywalnie z ET-3 lub jakimkolwiek z dużych ET. Analiza histologiczna. W analizach histologicznych serca embriony utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie i zatopiono w parafinie. Ciągłe 4- seryjne sekcje całych zarodków wykonano w kierunku poprzecznym i strzałkowym i zabarwiono hematoksyliną i eozyną. Przekrojowa hybrydyzacja in situ. Przekrojowe hybrydyzacje in situ dla mRNA ECE-2 przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (7, 13). W celu wytworzenia rybosondy, fragment XbaI-XhoI o długości 448 pz mysiego cDNA ECE-2 poddano transkrypcji w kierunkach sensownym i antysensownym i stosowano równolegle. Wyniki Rozkład tkankowy mRNA ECE-2 u myszy dorosłych. Przebadaliśmy ekspresję mRNA ECE-2 w różnych dorosłych tkankach myszy za pomocą analizy Northern blot i porównaliśmy ją z ekspresją mRNA ECE-1 (Figura 1). MRNA ECE-2 ulegał ekspresji przede wszystkim w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym w mózgu, móżdżku i przysadce mózgowej, a następnie w nadnerczach, jajniku i macicy
[hasła pokrewne: mazak gostyń, toksyczni rodzice chomikuj, beata rusin komornik ]
[więcej w: komornik beata rusin, beata rusin komornik, komornik sądowy beata rusin ]