Zakłócenie ECE-1 i ECE-2 ujawnia rolę enzymu konwertującego endotelinę-2 w mysim rozwoju serca ad

Trwały truncus arteriosus (PTA) występuje tylko w bardzo małej liczbie przypadków. W niniejszym badaniu zbadaliśmy możliwość, że duży ET-1 jest substratem in vivo dla ECE-2 i badał możliwą rolę ECE-2 w rozwoju embrionalnym. MRNA ECE-2 był najbardziej obficie eksprymowany w mózgu dorosłego, a następnie nadnerczy, jajnika i macicy. W rozwijającym się sercu mRNA ECE-2 ulegał ekspresji wyłącznie w mezenchymie torebek wsierdzia. Odkryliśmy, że ECE-2. /. myszy nokautowe były zdrowe w wieku dorosłym i płodne, nie wykazując wykrywalnych wad w rozwoju zarodkowym. Jednakże, gdy wszystkie zerowe allele ECE-2 zostały wprowadzone do tła zerowego ECE-1, wady serca stały się poważniejsze niż te obserwowane w ECE-1 (3 /. pojedyncze mutanty. Wskazuje to na funkcjonalną redundancję między ECE-1 i ECE-2 w rozwoju embrionalnym. Metody Myszy. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Doradczy ds. Opieki nad zwierzętami i badań w Centrum Medycznym Uniwersytetu Teksańskiego w Southwestern. Myszy z niedoborem ECE-1 wytworzono przez rekombinację homologiczną, jak opisano uprzednio (12), utrzymywano na hybrydowym podłożu genetycznym C57BL6 / J-129 / SvEv i trzymano w konwencjonalnej kolonii zwierzęcej z 14-godzinnym lekkim / 10-godzinnym cykl ciemny. Kierowanie na geny. W celu wyizolowania mysiego fragmentu genomowego ECE-2 przeszukiwano bibliotekę genomowego DNA AIXIX II z genem FIX II (Stratagene Inc., La Jolla, Kalifornia, USA) z sondą cDNA ECE-2 110 pz opisaną poprzednio (11). . Zostały wyizolowane dwa klony fagowe obejmujące fragment DNA o długości 14 kb zawierający katalityczną domenę ECE-2. Aby skonstruować wektor docelowy, użyliśmy opisanego wcześniej uniwersalnego wektora plazmidowego neo-TK (9). A 3. homologiczny fragment 2,0-kb BamHI-SacI i 5. homologiczny fragment SalI 6,0 kb wklonowano w unikalne miejsca BamHI i XhoI wektora docelowego. Eksony kodujące wiążącą cynk domenę katalityczną ECE-2 zastąpiono nową lub inną kasetą (patrz Figura 3a). Komórki ES SM-1 pochodzące ze szczepu myszy 129 / SvEv hodowano na napromieniowanej warstwie karmnika STO wytwarzającego LIF, transfekowano liniowym wektorem docelowym i podwójnie selekcjonowano w G418 i FIAU, jak opisano poprzednio (9). Klony, które przeżyły, pobierano pojedynczo, a rekombinację homologiczną potwierdzono za pomocą PCR z primerami w 3. część genu neor i region genomowy ECE-2 na zewnątrz krótkiego ramienia (patrz Figura 3a i dane nie przedstawione). Rekombinowane zarodkowe klony komórek macierzystych (ES) wstrzyknięto do blastocyst otrzymanych od samic C57BL6 / J, a uzyskane chimeryczne samce pokrzywiły się z samicami C57BL6 / J, aby uzyskać myszy F1 niosące docelowy allel. Rysunek 3Generacja ECE-2. /. myszy za pomocą rekombinacji homologicznej. (a) Strategia kierowania. Ekson kodujący domenę wiążącą cynk ECE-2 jest zastąpiony przez nową kasetę napędzaną przez promotor polimerazy RNA II. Dwa tandemowe powtórzenia kinazy tymidynowej (TK) są wykorzystywane do selekcji negatywnej za pomocą FIAU (patrz Metody). Startery PCR w genie neor i 3. region zewnętrzny krótkiego ramienia wektora docelowego są pokazane strzałkami. Numery eExon są wskazane zgodnie z odpowiednimi eksonami ludzkiego genu ECE-1 (32); inne eks ECE-2 nie są pokazane. (b) Analiza typu Southerna DNA ogonowego pochodzącego od potomstwa ECE-2 + /. skrzyżowanie. DNA strawiono BamHI i hybrydyzowano z 3. sonda (oznaczona szarym polem w panelu a). ko, ukierunkowany allel; wt, allel typu dzikiego. (c) RT-PCR transkryptu ECE-2 z użyciem całkowitego RNA wyekstrahowanego z mózgu ECE-2 + / +, ECE-2 + / a, i ECE-2 P / l. myszy. Startery amplifikują egzon kodujący istotną domenę ECE-2 wiążącą cynk. Górny panel pokazuje, że fragment transkryptu o wielkości 160 pz wykryto w dzikiego typu i ECE-2 + / p. myszy, ale jest nieobecny w ECE-2. /. myszy. Środkowy panel pokazuje, że nie wykryto transkryptów bez inkubacji RT. Dolny panel pokazuje wykrywanie transkryptów (3-aktyny, wskazując nienaruszone preparaty RNA we wszystkich ścieżkach. Genotypowanie. Genomowy DNA przygotowywano z biopsji ogona w dniu 21 po urodzeniu lub z worka żółtka zarodka i poddawano analizie PCR i / lub analizie Southern blot. Startery oligonukleotydowe stosowane do wykrywania allelu ECE typu dzikiego były następujące: powyżej, 5 (3 -GCCATCTTACAGTAGAGGAG-3. i poniżej, 5a-CTAGAATGGGCCCCTACCTT-3 .. Startery stosowane do wykrywania zmutowanego allelu były: powyżej, 5 (3-GGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGA-3. i poniżej, 5a-ACCATGCAGACCCAACTATGCTTCT-3 .. Reakcję poddano cyklizacji 30 razy (30 sekund w 94 ° C, minuta w 60 ° C i 3 minuty w 72 ° C), która zamplifikowała fragment o około 800 parach fragmentu genu ECE-2 rozbijanego w mutancie allel (do wykrywania allelu typu dzikiego) i fragment 2,3 kb obejmujący gen neor i krótkie ramię wektora docelowego (do wykrywania zmutowanego allelu) (patrz Figura 3a)
[patrz też: taksidi club, fenistil ulotka, ubezpieczenie nfz za granicą ]
[hasła pokrewne: fenistil ulotka, supradyn opinie, szpital psychiatryczny toszek ]