Wirusowa indukcja fenotypu przewlekłej astmy i segregacja genetyczna z ostrej odpowiedzi cd

RNA płuc ekstrahowano za pomocą TRIzol (Invitrogen Corp., Grand Island, Nowy Jork, USA) i mini zestawu RNeasy (QIAGEN Corp., Valencia, California, USA). Wyekstrahowany RNA poddano następnie RT-PCR, stosując system One-Step TaqMan (PE Biosystems) do wykrywania wirusowego negatywnego i dodatniego nici RNA. Syntetyczne standardy RNA dla białka nukleokapsydu i kontrolnego GAPDH wytworzono z fragmentów genu białka nukleokapsydu (nukleotydy 10 [620] i gen GAPDH (nukleotydy 37 [910] wklonowano do pCR2.1 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA) i były transkrybowane in vitro przy użyciu T7 MEGAscript (Ambion Inc., Austin, Texas, USA). Standardy oczyszczono przez ekstrakcję TRIzolem, traktowanie DNazą (trzy rundy), preparat mini-zestawu RNeasy (trzy rundy) i ekstrakcję fenolem, a następnie przepuszczanie w dwóch powtórzeniach seryjnych rozcieńczeń w celu skonstruowania standardowych krzywych i obliczenia liczby kopii RNA swoistego dla wirusa w eksperymentalnym próbki. Histochemia. Mysie płuco (przy 25 cm H2O ciśnienia) utrwalono w 10% buforowanej formalinie, odwodniono w etanolu, zatopiono w parafinie i pocięto na sekcje o grubości 5 urn. W celu wykrycia ICAM-1, skrawki tkanki zostały zablokowane 5% nieimmunologiczną surowicą kozią, a następnie inkubowane sekwencyjnie z mysim przeciwciałem IgG mAb ICAM-1 IgG (2 .g / ml klonu 3E2 z Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA), biotynylowane kozie przeciwciało przeciw chomiczce IgG (7,5 .g / ml), peroksydaza chrzanowa skoniugowana ze streptawidyną i chromogen 3,3 -diaminobenzydyny (Vector Laboratories Inc., Birmingham, Kalifornia, USA). Skrawki również wybarwiono immunologicznie na mucynie MUC5AC i poddano trawieniu amylazą i barwieniu błękitem Alcian / okresowym A-Schiff (PAS) jako wskaźnikom wytwarzania śluzu i odpowiadających poziomów komórek kubkowych (44). W celu barwienia immunologicznego MUC5AC, tkanki blokowano mysim IgG (Vector Laboratories Inc.), a następnie inkubowano z mysim antyludzkim MUC5AC mAb 45M1 (2 .g / ml, Lab Vision Corp., Fremont, Kalifornia, USA). Skrawki tkanki wybarwiono kontrastowo hematoksyliną, odwodniono w gradiencie etanolu i zamontowano do fotomikrografii i oznaczenia ilościowego reportera przez zliczanie komórek (komórki na mm błony podstawnej), obszar nabłonka (procent całkowitej powierzchni nabłonka obliczono za pomocą Image-Pro Express wersja 4; Media Lybernetics, Carlsbad, California, USA) i intensywność wybarwienia nabłonka (obliczona przy użyciu Optimas wersji 5, Optimas Corp., Bothell, Washington, USA), jak opisano wcześniej (30, 31). Analiza płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe wykonywano przez kaniulację tchawicy z podwielokrotnością 0,8 ml sterylnego PBS z 2% FBS. Każdą próbkę poddano lizie hipotonicznej, wirowaniu cytospiny i barwieniu Wright-Giemsa, a następnie stosowano do całkowitej i różnicowej liczby komórek. Reaktywność dróg oddechowych. Reaktywność dróg oddechowych w odniesieniu do aerozolizowanej metacholiny określono przy użyciu jednokomorowego pletyzmografu z całym ciałem i oprogramowania BioSystem XA wersja 1.5.7 (Buxco Electronic Inc., Sharon, Connecticut, USA) w celu uzyskania wartości dla ulepszonej pauzy (Penh), jak opisano wcześniej (45). ). Myszy umieszczono w pletyzmografie na 5-minutowy okres aklimatyzacji, a następnie 5-minutowe okresy akwizycji przed (linia podstawowa Penh) i po 3-minutowej ekspozycji na rozpylony nośnik (PBS) lub podwojenie stężenia metacholiny (5. 160 mg / ml ) dostarczonego z nebulizatora Collison 6 (BGI Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Wyzwanie dla alergenów. Myszy C57BL / 6J uczulano, a następnie prowokowano antygenem przy użyciu metody zmodyfikowanej z wcześniej opisanej (46). Myszy immunizowano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie owoalbuminy (Ova, 8 ug) zaadsorbowanej na żelu z wodorotlenku glinu (1 mg) w 0,5 ml PBS na 3 tygodnie przed prowokacją (dzień badania. 21) i podawano identyczną immunizację przypominającą 2 tygodnie przed wyzwanie (dzień. 14). Myszy prowokowano PBS lub Ova (2 mg) w PBS (50 ul) podawanym donosowo, jak opisano powyżej, w celu zaszczepienia wirusa. Wyzwania przeprowadzono z donosowym PBS lub Ova albo dwa razy (w odstępie 12 godzin) w dniu 0 (w sumie dwa wyzwania) lub dwa razy w dniu 0 i ponownie raz w dniach i 2 (w sumie cztery wyzwania). W dniach 3, 21 i 77 po początkowym prowokacji, wszystkie myszy oceniano pod względem reaktywności dróg oddechowych i przerostu komórek kubkowych, jak opisano powyżej. Analiza statystyczna. Wartości dla liczby komórek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, ubytków masy, Western blot i miana wirusów analizowano stosując niesparowany test t Studenta. Wartości Penh i histochemii mysich tkanek analizowano stosując jednoczynnikową ANOVA dla doświadczalnego projektu czynnikowego. Jeśli istotność osiągnięto przez jednokierunkową analizę, porównanie średnich po ANOVA przeprowadzono za pomocą testu Scheffe a F
[hasła pokrewne: 6 filarów poczucia własnej wartości pdf, mazakzabawki, ubezpieczenie nfz za granicą ]
[patrz też: komornik sądowy beata rusin, duszacy kaszel, mazak gostyń ]