Uraz zwiększa funkcję TLR2 i ekspresję peptydów przeciwdrobnoustrojowych poprzez mechanizm zależny od witaminy D ad 8

Konstrukty skórne zostały pocięte po stymulacji i przeniesione do Tri zol (Invitrogen) w celu ekstrakcji RNA lub natychmiast zamrożone w Tissue-Tek (Sakura) do immunobarwienia. Ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym. RNA ekstrahowano z komórek, struktur naskórkowych lub tkanki za pomocą Tri zol, a 1. G RNA poddano odwrotnej transkrypcji z użyciem iScript (Bio-Rad). Ekspresję katelicydyny i GAPDH analizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), jak opisano wcześniej (11). Wstępnie opracowane sondy testowe TaąMan (Applied Biosystems) zastosowano do analizy ekspresji CYP24A1, CYP27B1, CD14, CD36, TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 i mysiego CD14. Wszystkie analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach z 2. 5 niezależnych eksperymentów w ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Zrzut indukcji w stosunku do kontroli traktowanej nośnikiem w doświadczeniach in vitro został obliczony przy użyciu metody porównawczego cyklu progowego (Ct), w której. Ct oznacza. Ctstimulant. . C4, Ct oznacza Ctgene. CtGAPDH i Ct to cykl, w którym przekroczony jest arbitralny próg wykrywalności. W celu ilościowego oznaczenia obfitości transkryptu w próbkach tkanek, ekspresję genu docelowego znormalizowano do GAPDH i porównano ze skórą nieleczoną lub nieleczoną. Analiza promotora i ukierunkowana mutageneza. Aby przeanalizować aktywność transkrypcyjną, fragment o długości 5 500 pz z 5. nieulegający translacji region CAMP amplifikowano ze starterami 5. -CACACCTAGCGGAACCCCTGGACAACGG-3. (pGL3 500, sens) i 5 (3-GAGAGACTCGAGGTCTGCCTCCCTCTAGCC-3. (pGL3 1500, antysensowny) z użyciem ludzkiego genomowego DNA jako matrycy. Startery zaprojektowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego NheI w pozycji 5. koniec i miejsce restrykcyjne XhoI na 3. koniec amplikonu. Produkt amplifikacji klonowano do wektora TOPO (Invitrogen) i transformowano do komórek One Shot TOP10 Electrocomp E. coli (Invitrogen). Po oczyszczeniu DNA przy użyciu Wizard Plus, systemu oczyszczania SV Miniprep (Promega), konstrukt strawiono NheI i XhoI, a następnie subklonowano do bez promotora pGL3-podstawowego wektora lucyferazy świetlika (Promega). Funkcjonalną rolę wcześniej opisanego VDRE (6) do transkrypcji CAMP badano przez ukierunkowaną mutagenezę VDRE. VDRE w pozycji. 619 pz do. 633 bp w stosunku do miejsca startu translacji zostało usunięte ze starterami 5a-AACTTCTGCTTCAGTGATTCTCAT-3. (sens) i 5. -ATGAGAATCACTGAAGCAGAAGTT-3. (antysensowny) przy użyciu protokołu opublikowanego przez Prinzen i in. (38). Uzyskany plazmid pozbawiony miejsca wiązania VDRE sklonowanego w wektorze podstawowym pGL3 nazwano pGL3 1500 VDRE. Wszystkie otrzymane konstrukty potwierdzono przez sekwencjonowanie. W celu transfekcji komórki HaCaT wysiewano na 24-studzienkowe płytki (BD Biosciences) i stosowano do transfekcji przy konfluencji 50%. 70%. Komórki transfekowano plazmidami reporterowymi CAMP i 0,1 ng wewnętrznego kontrolnego plazmidu do ekspresji lucyferazy Renilla (Promega), stosując 1,5 ul odczynnika do transfekcji Fugene 6 (Roche Diagnostics) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki stymulowano Malp-2 i 1,25D3 6 godzin po transfekcji i inkubowano 24 godziny przed pobraniem z 50 ul pasywnego buforu do lizy (Promega). Aktywność lucyferazy Firefly z wektorów reporterowych cAMP pGL3 i aktywności lucyferazy Renilla mierzono za pomocą systemu podwójnej lucyferazy (Promega) w luminometrze (Optocomp I, MGM Instruments). Aktywność promotora została opisana jako stosunek aktywności świetlika i lucyferazy Renilla w każdej próbce. Immunobarwione. Po utrwaleniu w 2% PFA i kolejnych przemyciach w PBS, fragmenty tkanki skórnej lub struktur naskórkowych blokowano w 3% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej i wybarwiano pierwszorzędowym przeciwciałem anty-katelicydyna LL-37 lub surowicą przed immunizacją, jak opisano wcześniej. (39). Po przemywaniu w PBS, szkiełka z naskórkowych konstruktów powtórnie sondowano kozim przeciwciałem przeciw-kurczęcym znakowanym FITC. Jądra wykryto za pomocą DAPI. Po kolejnych przemyciach PBS, szkiełka zostały zamontowane w odczynniku ProLong Anti-Fade (Invitrogen) i ocenione za pomocą mikroskopu Olympus BX41 (Olympus). Zatopione w parafinie skrawki tkanek utrwalone w formalinie zostały ponownie uwodnione w serii toluenu, etanolu i PBS. Endogenną aktywność peroksydazy zgaszono przez 30 minut inkubacji w 0,3% H2O2 w wodzie i skrawki poddawano działaniu mikrofal przez 4 minuty w roztworze do odzyskiwania antygenu (0,01 M kwas cytrynowy, 0,05 M NaOH, pH 6,0). Skrawki blokowano 2% surowicą kozią w PBS, 3% BSA, a następnie inkubowano z króliczym przeciwciałem anty-LL-37 (18) lub anty-TLR2 (Abcam) w PBS, 0,1% BSA. Skrawki płukano w PBS i wykryto biotynylowane drugorzędowe przeciwciała (Vector Laboratories) i substrat diaminobenzydynowy (Sigma-Aldrich) u producentów. instrukcje. Western blot
[więcej w: komornik sądowy beata rusin, klinika bocian białystok, test obciążenia glukozą 75g normy ]
[patrz też: ziaja dermatologiczna baza z tlenkiem cynku, test obciążenia glukozą 75g normy, vegamedica ]