Środek obrazujący PET do oceny ekspresji PARP-1 w raku jajnika ad 7

Badania te powinny dostarczyć bodźca dla wieloośrodkowych badań klinicznych, aby w pełni ocenić znaczenie ekspresji PARP-1 jako biomarkera do terapii nowotworowej i technologicznych zalet FTT [18F] do pomiaru wewnątrzmacicznego i między nowotworowego ekspresji PARP-1 w porównaniu do konwencjonalnych podejść IHC . Metody Projekt badań. Celem tego badania było podkreślenie znaczenia ekspresji PARP-1 w terapii inhibitorami PARP przy użyciu przedklinicznych modeli raka jajnika i wykonanie pierwszego badania obrazowania PARP-1 pod kątem PET w raku jajnika z zastosowaniem [18F] FTT z korelatami histologicznymi w celu potwierdzenia wskaźnika promieniotwórczego wychwyt jako biomarker ekspresji PARP-1. Ten cel został rozwiązany za pomocą CRISPR / Cas9 w celu usunięcia PARP1 w modelach raka jajnika, które następnie wykorzystano do testowania skuteczności PARPi in vitro. Ponadto wykorzystaliśmy uzyskane z pacjenta modele ortotopowego ksenoprzeszczepu raka jajnika, aby pokazać dowód koncepcji obrazowania za pomocą [18F] FTT microPET sprzężeń docelowych leków PARP-1 i PARPi in vivo. [18F] Obrazowanie FTT PET z PARP-1 wykonywano u pacjentów z rakiem jajnika, a próbki nowotworów pobierano podczas chirurgicznego usuwania lub biopsji w celu korelacji in vitro PARP-1 przy użyciu autoradiografii [125I] KX1 i PARP-1 f-IHC . Wszystkie eksperymenty in vitro przeprowadzono przy użyciu standardowej techniki hodowli komórek i powtórzono 3 niezależne czasy. Delecję PARP1 z CRISPR / Cas9 przeprowadzono w 2 liniach komórkowych raka jajnika. Dodatkowo, do kierowania delecją PARP1 użyto 3 unikalnych przewodnich RNA. Poliklonalne populacje linii komórkowych PARP1-KO zastosowano do testowania skuteczności PARPi in vitro. Wybrano próbkę o wielkości 4 dla przedklinicznych badań obrazowych, aby zapobiec odchyleniu większemu niż 10% w celu interpretacji i analizy wyników obrazu microPET. Żadne dane z modeli przedklinicznych nie zostały wyłączone z analiz. Do klinicznej części tego badania włączono 20 pacjentów z EOC, z których 10 miało dostępną tkankę do analizy in vitro. Osiem z tych 10 przeszło obrazowanie [18F] FTT przed późniejszym standardowym leczeniem klinicznym (Figura 3). Jeden z 8 pacjentów, u których wykonano [18F] FTT, miał ujemny obraz PET i został wyłączony z analizy korelacyjnej. Łącznie 13 próbek tkanek było dostępnych od 10 pacjentów, a próbki te wykorzystano do testów in vitro, w tym autoradiografii PARP-1 f-IHC i [125I] KX1 (Tabela uzupełniająca 5). Wszystkie próbki tkanek od pacjentów poddanych obrazowaniu PET [18F] FTT były zawarte w korelacjach między [18F] FTT PET, [18F] FDG, [125I] autoradiografią KX1 i PARP-1 f-IHC. Wszystkie próbki tkanek pobrane od pacjentów objętych badaniem uwzględniono w korelacjach między [125I] KX1 i PARP-1 f-IHC. Pacjenci z mutacjami BRCA1 i bez nich byli włączani do tego badania (Tabela uzupełniająca 6). Wszystkie procedury eksperymentalne dotyczące pracy przedklinicznej i klinicznej są szczegółowo opisane w informacjach uzupełniających. CRISPR / Cas9 delecja PARP1 w komórkach raka jajnika. Komórki OVCAR8 były prezentem od Davida M. Livingstona (Dana Farber Cancer Institute, Boston, Massachusetts, USA). Wszystkie inne linie komórkowe były dostępne przez ATCC lub Basser Center dla BRCA (University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, USA) (Tabela dodatkowa 1). PARP1 usunięto w liniach komórek EOC UWB1.289 i OVCAR8, które mają zmniejszoną ekspresję BRCA-1 poprzez szkodliwą mutację (UWB1.289) lub metylację promotora (OVCAR8). Mutacje te scharakteryzowano gdzie indziej w literaturze (46, 47). Korzystając z 3 unikalnych przewodników RNA (materiału dodatkowego), w delecji PARP1 pośredniczył Cas9 w obu liniach komórkowych, skutecznie wytwarzając 3 unikalne poliklonalne linie komórkowe PARP1-KO dla każdej z nich. Utratę ekspresji PARP-1 potwierdzono przez mikroskopię komórkową IF i Western blot w każdej populacji poliklonalnej. Populacje poliklonalne zastosowano we wszystkich doświadczeniach. [125I] Wiązanie radioliganda KX1 mierzy różnice w ekspresji PARP-1. Korzystając z wielu linii komórkowych raka jajnika, przeprowadziliśmy badania farmakologicznego nasycenia radioligandem saturacji PARP-1 in vitro w celu ilościowej oceny ekspresji PARP-1. [125I] Zsyntetyzowano KX1 i przeprowadzono badania wiązania radioliganda in vitro, jak opisano wcześniej (16). W skrócie, rosnące stężenia [125I] KX1 od 0.01 <10 nM dodano do 96-studzienkowej płytki z czterokrotnym powtórzeniem dla każdej odpowiedniej linii komórkowej i eksperymenty zakończono trzykrotnie. Utrata PARP1 promuje oporność na PARPi w liniach komórkowych raka jajnika. Immunofluorescencję zastosowano do określenia uszkodzenia DNA wywołanego przez olaparib lub kontrolę DMSO w liniach komórkowych raka jajnika. Stosując 5 klinicznie stosowanych PARP, przeprowadziliśmy testy żywotności komórek in vitro w celu określenia zmian w czułości leku na podstawie utraty ekspresji PARP-1 [więcej w: toksyczni rodzice chomikuj, sanatorium krystyna busko, 6 filarów poczucia własnej wartości pdf ] [więcej w: komornik sądowy beata rusin, duszacy kaszel, mazak gostyń ]