Selektywny inhibitor osteoklastycznej V-H + -ATPazy zapobiega utracie masy kostnej zarówno u szczurów wyciętych tarczycy, jak i po wycięciu jajników czesc 4

Dorosłe samice szczurów Sprague-Dawley o wadze 250 g podzielono na sześć grup po osiem zwierząt każda: grupy 1. 3 (grupy kontrolne) miały swobodny dostęp do wody wodociągowej; grupy 4. 6 (szczury obciążone kwasem) miały swobodny dostęp do wody pitnej zawierającej 280 mM (1,5%) NH4Cl plus 1% sacharoza, przez 8 dni. Wszystkie szczury karmiono standardową dietą laboratoryjną dla gryzoni (Mucedola 4RF21; Settimo Milanese). Dieta zawierała 1,260 IU / kg witaminy D3, a estrogen był nieobecny. Objętość, pH i całkowita kwasowość moczu oraz pobór wody były monitorowane codziennie. W dniu 2, gdy szczury obciążone kwasem wykazywały trwałą kwasicę, wszystkie grupy traktowano doustnie nośnikiem (grupy i 4), SB 242784 w dawce 5 mg / kg (grupy 2 i 5) i SB 242784 w dawce 10 mg / kg (grupy 3 i 6). Pomiary całkowitej kwasowości w moczu. Wolną kwasowość oceniano przez miareczkowanie próbek moczu za pomocą 0,01 M NaOH o pH 7,4. Zawartość NH4 + określono przez enzymatyczną bioanalizę (Boehringer Ammonia Kit). Całkowitą kwasowość moczu mierzono jako sumę zawartości wolnych kwasów i amonu i wyrażono w ekwiwalentach na litr (N). Pomiary bilansu amonowego. Bilans amonowy obliczono dzieląc zawartość NH4 + w moczu przez dzienne spożycie NH4 +, oba wyrażone jako milirównoważniki dziennie. Analiza statystyczna Test cytochemiczny Mg2 + -ATPazy in situ i histomorfometria. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu t (dwustronnego). Hiperkalcemia wywołana przez retinoid Ro 13-6298 u szczurów TPTX i osteoporoza wywołana przez wycięcie jajników u szczurów. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programów RS1 / Explore (BBN Software Products, Cambridge, Massachusetts, USA). Dane wyrażono jako średnią plus lub minus błąd standardowy dla każdej grupy. Analiza wszystkich parametrów oparta była na dwukierunkowej ANOVA. Gdy wskazano istotne różnice, efekty leczenia porównywano za pomocą procedury wieloprofilowej. Wartość AP niższa niż 0,05 została uznana za znaczącą. Wyniki Hamowanie badań selektywności V-H + -ATPazy in situ. Test ten pozwala na oznaczanie ilościowe aktywności ATP-azy w poszczególnych komórkach in situ i zastosowano go do oszacowania względnego wpływu SB 242784 na V-H + -ATPazę w kilku tkankach małpy ludzkiej i makaka jawajskiego. Jak omówiono w Metodach, test opiera się na zastosowaniu kompleksu LACA środka wychwytującego fosforany, co wyklucza zastosowanie niezagrupowanych odcinków kości ludzkiej i małpiej. Aby temu zaradzić, aktywność V-H + -ATPazy osteoklastów badano na wielu odcinkach z sześciu różnych osteoklastów. Aktywność V-ATPazy była hamowana przez bafilomycynę w sposób zależny od dawki (Figura 2a). W oparciu o wrażliwość na bafilomycynę około 25% aktywności Mg2 + -ATPazy stanowiła V-H + -ATPaza w osteoklastach i komórkach kanalika proksymalnego skurczowego nerki (KPC) (Figura 2a). Pozostała aktywność stanowi mikrosomalną / mitochondrialną niewrażliwą na bafilomycynę Mg2 + -ATPazę (y). Figura 2 Wpływ SB 242784 na aktywność całkowitej aktywności Mg2 + -ATPazy. Wyniki wyrażono jako MIE × 100. SEM. (a) Wpływ bafilomycyny-A1 (baf-A1, kwadraty) i SB 242784 (diamenty); AP <0,001 względem kontroli (najniższe osiągnięte stężenie). (b) Wpływ SB242784 na aktywność osteoklastu Mg2 + -ATPazy, komórki KPC (kwadraty) i wątrobowe hepatocyty (trójkąty). AP <0,001 względem kontroli; BP <0,05 w porównaniu do kontroli. (c) Dodatkowy wpływ bafilomycyny i SB 242784 na aktywność Mg2 + -ATPazy w ludzkich osteoklastach. AP <0,001 względem kontroli. (d) Wpływ SB 242784 na aktywność Mg2 + -ATPazy w ludzkich osteoklastach (romby), małpach makaka jawajskiego (CM) (puste kwadraty), komórkach mikrogleju CM (mózg, trójkąty) i hepatocytach wątrobowych CM (zamknięte kwadraty). AP <0,001, BP <0,05, CP <0,02, DP <0,005, wszystko względem kontroli. Dla każdego badanego stężenia SB 242784 (0. 50. M), seryjne skrawki badano w obecności 10 nM bafilomycyny (oszacowane 100% hamowania V-H + -ATPazy) i 10 nM bafilomycyny plus 50. M SB 242784 (do ustalić, czy SB 242784 hamuje składnik niewrażliwy na bafilomycynę). Ludzka osteoklasta Mg2 + -ATPaza była silnie hamowana przez SB 242784 (Figura 2b). W oparciu o wrażliwość na bafilomycynę (szacowane maksymalne hamowanie przy 10 nM), osteoklast V-H + -ATPaza był znacząco hamowany przez SB 242784 przy oszacowanym IC50 poniżej 5 nM. Wpływ SB 242784 na aktywność V-H + -ATPazy w ludzkich komórkach kanalików KPC i wątrobowych hepatocytach pokazano również na Figurze 2b. Komórki nerkowe i wątrobowe nie wykazały hamowania zależnego od stężenia aż do 5 | jM, ale wykazywały odpowiednio 40% i 80% inhibicji przy maksymalnym stężeniu 50 | jM. Porównanie między komórkami guza olbrzymiokomórkowego, śledziony i żołądka ujawniło podobny profil selektywności osteoklastów (nie pokazano) [przypisy: staw ramienno promieniowy, klinika bocian białystok, toksyczni rodzice chomikuj ] [hasła pokrewne: hydrokolonoterapia poznań, hydrokolonoterapia wrocław, raven market ]