Selektywny inhibitor osteoklastycznej V-H + -ATPazy zapobiega utracie masy kostnej zarówno u szczurów wyciętych tarczycy, jak i po wycięciu jajników ad

Podstawą testu jest zastosowanie kompleksu wychwytującego fosforany ołowiowo-amonowego cytrynianu / octanu (LACA). Wolny fosforan generowany przez endogenną enzymatyczną hydrolizę egzogennie dodanego ATP (w pojedynczych komórkach sekcji tkanki) konkuruje z cząsteczkami cytrynianu amonu i wytrąca fosforan ołowiu, który można przekształcić w kolorowy (brązowo-czarny) osad siarczku ołowiu za pomocą siarczku amonu. Świeże, nieutrwalone, 8-.m skrawki kriostatu preinkubowano przez 15 minut w 37 ° C w 10% roztworze Polypep 5115 w 0,2 M buforze Tris, pH 7,5, w celu usunięcia wolnego fosforanu. Skrawki inkubowano w 37 ° C przez 10 minut w środowisku reakcji zawierającym 4 mM ATP, 50 mM MgCl2 i 8 mg / ml LACA w 10% Polypep 5115 w 0,2 M buforze Tris, pH 7,5. Wszystkie odczynniki zostały dostarczone przez Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Test przeprowadzono na odcinkach seryjnych zawierających wzrastające stężenia bafilomycyny (0, 0,001 l. 10 nM) lub SB 242784 (0, 0,005. 50. M). Serialne skrawki badano również w obecności 10 nM bafilomycyny i 10 nM bafilomycyny plus 50 | jM SB 242784. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu t. Produkt reakcji oznaczono ilościowo za pomocą mikroskopu skaningowego i integrującego Vickers M85, spektrofotometru zbudowanego wokół mikroskopu. Instrument ten ułatwia pomiar ilości chromoforu w poszczególnych komórkach za pomocą tarczy światła widocznej dla operatora, ale nie fotopowielacza instrumentu. Miejsce światła o znanej długości fali jest następnie przesyłane przez obiektyw i na próbkę. Punkt ten przemieszcza się w komórce zgodnie z rastrem, a następnie przechodzi do fotopowielacza. Instrument następnie sumuje wszystkie zmierzone absorpcje dla obszaru zeskanowanego. Punkt wykonuje pomiary tylko w obszarze wybranym przez dysk świetlny. Stosując filtr o znanej absorbancji, bezwzględne średnie zintegrowane wygaszenie (MIE) można określić dla każdej komórki. Trzydzieści komórek mierzono w potrójnych zestawach wycinków: ludzkiej nerki małpy (komórki proksymalne) i wątroby (hepatocytów); mózg małpy; ludzka śledziona, żołądek, serce i guz olbrzymiokomórkowy (bogaty w osteoklasty). Randomizowane pomiary były rejestrowane jako ślepe w różnych miejscach dla każdej sekcji z ustawieniami przyrządu w następujący sposób: rozmiar maski odpowiedni dla próbki, cel x 40 i plamka o wielkości 0,5 .m przy długości fali 580 nm. Wyniki przedstawiono jako MIE × 100. SEM lub wyrażone jako procent kontroli. We wszystkich typach komórek aktywność ATPazy była zależna od substratu i magnezu i liniowa z czasem do 30 minut. W teście pominięto jony Na + lub K +, a zatem wrażliwa na ouabainę (0,4 mM) aktywność Na + / K + -ATPazy w obrębie odcinków tkanek była nieistotna. Szczawian L-bromotetramizolu (0,4 mM, swoisty inhibitor fosfatazy alkalicznej) nie miał działania hamującego aktywność ATP-azy. Hiperkalcemia wywołana przez retinoid Ro 13-6298 u szczurów TPTX Zwierzęta / podawanie badanych związków. Zastosowana metoda była podobna do opisanej przez Trechsela (13). Męskie szczury Sprague-Dawley z toryropatią jamy macicy (TPTX) (Charles River, Calco, Włochy) o masie ciała 175 . 200 g utrzymywały 22. ° C, 12-godzinny cykl światło / ciemność, karmiony standardową dietą (Mucedola nr 4RF21, Settimo Milanese, Mediolan, Włochy) i woda ad libitum. Po tygodniu aklimatyzacji, podczas którego zwierzęta otrzymywały podskórnie ug tyroksylu co drugi dzień, mierzono całkowite stężenie wapnia w osoczu, a tylko szczury o wartościach wapnia mniejszych niż 1,75 mM uważano za TPTX. Szczury TPTX podzielono losowo na cztery grupy po osiem sztuk każda i umieszczono w pojedynczych klatkach. Retinoid Ro 13-6298 zsyntetyzowano zgodnie z procedurą opisaną przez Loeligera (14) i wstrzyknięto podskórnie w dawce 30 ug / szczura w 0,1 ml glikolu polietylenowego 300 z 10% etanolem przez 3 dni wszystkim zwierzętom. Jednocześnie, SB 242784, zawieszony w 1% metylocelulozy, podawano doustnie w dawkach 2,5, 5 i 10 mg / kg, odpowiednio dla grup 1-3, podczas gdy grupa 4 otrzymywała sam nośnik. Procedury analityczne. Próbki krwi pobierano z żyły ogonowej wszystkich zwierząt przed i 4 dni po pierwszym traktowaniu retinoidem i badanym związkiem. Następnie osocze otrzymano przez odwirowanie (4300 g przez 10 minut), a całkowity poziom wapnia zmierzono metodą spektrofotometrii absorpcji atomowej (Varian A400, Varian Inc., Palo Alto, California, USA). Stężenie wapnia w osoczu wyrażono w milimolach. Osteoporoza wywołana owariektomią u szczurów Zwierzęta / podawanie badanych związków. Trzy miesięczne samice szczurów Sprague-Dawley (Charles River Italy) o masie 220-260 g utrzymywano w wieku 22 lat. ° C, 12-godzinny cykl światło / ciemność, karmiony standardową dietą (Mucedola No
[więcej w: komornik beata rusin, wyparzanie słoików w piekarniku, mąka ziemniaczana jako puder ]
[patrz też: beata rusin komornik, komornik sądowy beata rusin, duszacy kaszel ]