Ocena stanu zapalnego i reakcji na leczenie w czasie rzeczywistym w mysim modelu alergicznego zapalenia dróg oddechowych cd

Dane są reprezentatywne dla co najmniej 3 niezależnych eksperymentów, z n = 3. 5 na eksperyment i na grupę. Dane są średnie. SEM. Wykrywanie in vivo aktywności MMP, w której pośredniczą eozynofile, koreluje z ciężkością choroby. Zastosowaliśmy różne podejścia do obrazowania in vivo, aby rozwiązać zależną od eozynofili aktywność MMP w mikroskopowych i makroskopowych rozdzielczościach u myszy wcześniej podawanych z czujnikiem ukierunkowanym na MMP. Analiza mikroskopowa w rozdzielczości międzykomórkowej obejmowała IVM miąższu płuca z wykorzystaniem ultracienkich celów kija i dostępu chirurgicznego dziurki od klucza (41). Podejście to pozwoliło na wykrycie sygnału o głębokości do 200 .m i wykazało aktywność pan-MMP w stanach zapalnych, ale nie w spoczynkowych płucach (Figura 2A). Prawie cała aktywność MMP pochodzi z pojedynczych komórek, które zostały zidentyfikowane jako eozynofile tkanek. To odkrycie sugeruje, że aktywne enzymy wywierają intensywną aktywność w obrębie lub na błonie komórkowej eozynofili, z ograniczoną aktywnością w przestrzeni pozakomórkowej. Zastosowaliśmy również FMT (Suplementowa Figura 2) do ilościowych rekonstrukcji stężenia fluorochromu w 3 wymiarach i przy rozdzielczości submilimiterowej przez całą mysz. Typowy odczyty monitorujący podczas znieczulenia izofluranem, który był stosowany podczas obrazowania FMT w celu unieruchomienia myszy, pokazał, że wdech obejmował tylko 10% . 20% cyklu oddechowego (nachylenie w dół na krzywej ciśnienie-czas; Supplemental Figure 3). Podczas wdechu ścianka klatki piersiowej przesuwa się, a przepona obraca się o około 1. 2 mm. Ponieważ obrazowanie było wykonywane nieustannie, nabycie sygnału fluorescencyjnego było silnie ważone w kierunku stanu wydechowego / nieaktywnego. Chociaż może występować pewien stopień efektów częściowej głośności lub artefaktów wywołanych ruchem, ruch ten mieścił się w zakresie rozdzielczości przestrzennej systemu FMT. Ponadto wybrano ilości będące przedmiotem zainteresowania w taki sposób, aby uniknąć najbardziej oddalonych 2 mm płuc, wykluczając w ten sposób obszary z potencjalnymi zależnymi od ruchu częściowymi efektami objętościowymi do kwantyfikacji. Zfuzowaliśmy rekonstrukcje FMT z rentgenem rentgenowskim wysokiej rozdzielczości (FMT-CT), aby poprawić wizualizację obrazu (Figura 2B, Suplementowa Figura 2C i Uzupełniające Wideo 1) i stwierdziliśmy, że aktywność MMP u myszy prowokowanych OVA zlokalizowanych centralnie do niższych tchawica i duże oskrzela lub prawy i lewy płat płuca. Aktywność centralnego MMP prawdopodobnie wynika z drogi podania alergenu (w którym przeprowadzono testy OVA), a następnie rekrutacji eozynofilów, głównego komórkowego źródła aktywności MMP, w błonie śluzowej dróg oddechowych. Wcześniejsze badania donoszą również o obecności populacji komórek zapalnych w przewodzącej błonie śluzowej dróg oddechowych (42). Ilościowa analiza aktywności FMT aktywności enzymów w miąższu płuc różnych kohort myszy wykazała istotnie zwiększoną aktywność MMP związaną z eozynofilami u zwierząt z cięższym zapaleniem alergicznym (ryc. 2, C i D, dodatkowe ryciny i 2 oraz uzupełniające wideo 2. 4) . Zarejestrowana aktywność enzymu dodatnio koreluje z infiltracją eozynofilową (Figura 2E) i ze stężeniem IL-5 (dane nie pokazane) w odpowiednich płynach BAL. Wycięte płuca analizowane za pomocą obrazowania metodą odbicia fluorescencji (FRI) potwierdziły nasze obserwacje in vivo (ryc. 2, F i G). Dane te wskazują, że aktywność in vivo reportera optycznego ukierunkowanego na MMP może służyć jako substytut odpowiedzi eozynofilowej występującej w drogach oddechowych. Figura 2 Wykrywanie in vivo aktywności MMP, w której pośredniczą eozynofile, koreluje z ciężkością choroby. Sens, uczulenie (× 1, raz, × 2, dwa razy); Chall, wyzwanie z OVA. (A) IVM wykazał aktywność pojedynczej komórki MMP w płucach w porównaniu do płuc kontrolnych. (B) Wirtualny trójwymiarowy rendering aktywności MMP w stanach zapalnych płuc u 2 różnych myszy i nabyty przez FMT-CT. Aktywność MMP zlokalizowana centralnie na niższej tchawicy i głównych oskrzeniach u myszy oraz na prawym i lewym płatku płuc w myszy 2. (C i D) Pomiar FMT aktywności MMP w całych płucach myszy bez (bez zastrzeżeń; ), umiarkowane (uczulone raz OVA / ałunem, pomarańczowe) lub silne (uczulone dwukrotnie z OVA / ałunem, czerwone) zapalenie dróg oddechowych. Pokazano myszy i 2 z B. (E) Aktywność MMP in vivo dodatnio korelowała z liczbą eozynofilów w płynach BAL. (F i G) FRI wyciętych płuc potwierdziło wyniki FMT. Przeprowadzono co najmniej 3 niezależne eksperymenty, przy czym n = 3. 5 na eksperyment i na grupę. Dane są średnie. SEM. * P <0,05, ** P <0,01 w porównaniu do grupy niegroźnej. Skalowane pręty: 50 urn (A); cm (B). Aktywowaliśmy MMP i aktywność katepsyny odpowiednio przy 680 nm i 750 nm, podczas procedur obrazowania FMT in vivo [przypisy: taksidi club, fenistil ulotka, toksyczni rodzice chomikuj ] [hasła pokrewne: helides cena, kromed grybów, fenistil ulotka ]