Ocena stanu zapalnego i reakcji na leczenie w czasie rzeczywistym w mysim modelu alergicznego zapalenia dróg oddechowych ad 8

Przefermentowane płuca przesączono przez jałową porowatą nylonową siatkę 40 .m i komórki przemyto i ponownie zawieszono w ml PBS z 0,1% BSA. Synteza samo-aktywującego proleku wirusyny. Pełne syntezy i charakterystyki samo-aktywującego proleku wirusyny i nieaktywującej viridyny zostały opisane wcześniej (61). W skrócie, viridynę wortmaninę (Wm) poddano reakcji w pozycji C11, otrzymując NBD-Wm (62). NBD-Wm poddano następnie reakcji z kwasem heksanowym N (Me) lub kwasem N (H) -heksanowym, a kwas karboksylowy przekształcono w ester N-hydroksysukcynowy (48). Ester N-hydroksysukcynimidu każdego z nich poddano reakcji z 70-kDa amino-dekstranem (Invitrogen). Samoczynnie aktywujący prolek wirusyny i kontrolny związek nieaktywujący są identyczne, z wyjątkiem grupy metylowej (Figura 4B), która kontroluje uwalnianie viridyny. Interwencja terapeutyczna. W badaniach odpowiedzi na leczenie grupy myszy uczulonych w dniach 0 i 14 podawano codziennie i przed procedurą prowokacji (dni 18, 19, 20 i 21) z iniekcją ip mg / kg deksametazonu (Sigma-Aldrich) w 100. L roztworem soli lub iniekcją dożylną 0,75 mg / kg samou-aktywującego proleku virydyny w 200 .l soli fizjologicznej. Myszy używane jako kontrole otrzymały iniekcję iv 0,75 mg / kg nieaktywnej wirydyny lub 0,75 mg / kg dekstranu (wszystkie w 200. L soli fizjologicznej) lub były prowokowane PBS. Myszy zobrazowano po 18. 24 h po ostatniej prowokacji, a BAL i płuca natychmiast otrzymano do analizy ex vivo. Analiza cytokin. Oznaczenie IL-5 w płynie BAL uzyskano za pomocą standardowego testu ELISA przy użyciu testu immunologicznego Quantikine (R & D Systems) zgodnie z protokołem producenta. mAbs i cytometria przepływowa. Zastosowano następujące przeciwciała: skoniugowane z APC anty-CCR3 (R & D Systems), sprzężone z FITC anty-CCR3 (R & D Systems), skoniugowane z PE anty-CD90 (klon 53-2.1, BD Biosciences), skoniugowane z PE anty-B220 (klon RA3-6B2, BD Biosciences), skoniugowany z PE anty-CD49b (klon DX5, BD Biosciences), skoniugowany z PE anty-NK1.1 (klon PK136, BD Biosciences), skoniugowany z PE anty-Ly-6G (klon 1A8, BD Biosciences) i skoniugowanym z APC anty-CD11b (klon M1 / 70, BD Biosciences). Liczbę eozynofili, monocytów / makrofagów, neutrofili i innych komórek określono jako całkowitą liczbę komórek na płuco pomnożoną przez procent każdego typu komórek zidentyfikowanego metodą cytometrii przepływowej (LSRII, BD Biosciences). IVM. Zastosowano prototypowy wielokanałowy pionowy laserowy skaningowy mikroskop fluorescencyjny (IV100; Olympus) do obserwacji wewnątrzlitowych (41). Obrazy zostały pozyskane za pomocą oprogramowania do obrazowania Fluoview (FV300, wersja 4.3, Olympus). Lasery stosowane do wzbudzania obejmowały 10-MW, 633-nm hel-neon i 18-MW, 748-nm laser diodowy. Sygnał emisyjny filtrowano przez rozdzielacz wiązkowy SDM 570 nm i SDM 750 nm oraz stosując odpowiednio filtry 650- do 700-nm i 770-nm filtry pasmowe. FMT. Myszy otrzymały 5 nmol MMPSense-680 lub ProSense-750 (oba z VisEn Medical) poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Sondy są oparte na polimerycznych rusztowaniach, które mogą być cięte przez docelową proteazę, co powoduje uwalnianie fluorochromów i rozległe wytwarzanie fluorescencji (odkamienianie). Długość fal wzbudzenia i emisji MMPSense-680 wynosiła 680. 10 nm i 700. 10 nm, odpowiednio. Długość fali wzbudzenia i emisji ProSense-750 wynosiła 750. 10 nm i 780. 10 nm. Czujniki te mają zgłoszony okres półtrwania we krwi około 24 godzin i są głównie usuwane z wątroby (46, 63). Myszy znieczulono przez inhalację izofluranu (2% izofluranu, 2 l / min tlenu) 24 godziny po podaniu sond, a włosy z klatki piersiowej i jamy brzusznej usunięto przez golenie i chemiczną depilację. Myszy zanurzono w płynie dopasowującym indeks w celu uproszczenia teoretycznych ograniczeń związanych z modelowaniem granicznym i obliczeniem propagacji światła i zobrazowano stosując dostępny w handlu system obrazowania FMT (FMT; VisEn Medical). Ilościowa rekonstrukcja trójwymiarowych map fluorochromów została oparta na algorytmach Born-forward (64), a myszy kontrolne nie uczulone i nie poddane prowokacji OVA służącej do normalizacji sygnału. Aby poprawić wizualizację sygnału i lokalizację anatomiczną, kilka myszy zostało również zobrazowanych za pomocą obrazowania metodą syntezy FMT-CT (64). FRI. Wycięte płuca obrazowano za pomocą FRI (BonSAI, Siemens) stosując filtry do wykrywania fluorescencji przy 700 i 750 nm. Dane analizowano przy użyciu OsiriX i wyrażano jako średnią zliczeń fluorescencyjnych na sekundę. Bronchoskopia i analiza obrazu NIRF. Bronchoskopię NIRF wykonano za pomocą introwolitycznego światłowodowego mikroskopu fluorescencji (Cellvizio Lab-660; Mauna Kea Technologies), który składa się z laserowej jednostki zbierającej skaning (wzbudzenie 660 nm, długości fali zbierania 680. 900 nm) i mikrokatolera światłowodowego S300 (pakiet 6.000 włókien obrazowych zawartych w średnicy 300-. M)
[patrz też: taksidi club, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, 6 filarów poczucia własnej wartości pdf ]
[więcej w: engerix b cena, protruzja krążka międzykręgowego, odziejsie ]