Inhibitory izomeraz białkowych disiarczkowych stanowią nową klasę środków przeciwzakrzepowych ad

Test wykazał stosunek sygnału do szumu wynoszący 116: 1, współczynnik wariancji 4,6% i współczynnik Z 0,83. Przebadaliśmy bibliotekę z 4900 związków, w tym około 3000 znanych związków bioaktywnych (Figura 1A). Badanie przesiewowe zidentyfikowało 18 hamujących związków reprezentujących 13 oddzielnych chemicznych rusztowań, w tym 3 flawonole. Flawonole są szeroko rozpowszechnionymi roślinnymi związkami polifenolowymi wzbogaconymi w powszechnie spożywaną żywność, taką jak gryka, jagody, herbata i warzywa. Spośród flawonoli, które zidentyfikowaliśmy, najskuteczniejszym inhibitorem PDI był kwercetyna-3-rutozyd (znany również jako rutyna), kwercetyna glikozylowana w pozycji 3 pierścienia pironu (pierścień C, rysunek 2). Kwercetyno-3-rutozyd hamował PDI w sposób zależny od dawki, przy IC50 wynoszącym 6,1 .M (1,1-10,7 .M, 95% przedział ufności) (Figura 1B i dodatkowa Figura 1A, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; 10.1172 / JCI61228DS1). Hamowanie PDI przez 3-rutynozynę kwercetyny potwierdzono w teście reduktazy opartej na fluorescencji, stosując utleniony glutation sprzężony z di-eozyną (Di-E-GSSG) (odnośnik 16 i dane nie pokazane). Hamowanie PDI przez 3-rutynozynę kwercetyny było całkowicie i szybko odwracalne (Suplementowa Figura 1B), co wskazuje, że 3-rutozyd kwercetyny nie wiąże kowalencyjnie PDI. Ocena wiązania kwercetyny-3-rutozydu z unieruchomionym PDI przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego wykazała wartość Kd 2,8 M M (ryc. 1C). Rycina 1Identyfikacja 3-rutozydu kwercetyny jako inhibitora PDI. (A) Dane z reprezentatywnych 384-studzienkowych płytek, w tym próbki bez PDI (zielone); 3 mM bacytracyny, niespecyficznego inhibitora rodziny oksydoreduktaz z rodziny PDI (niebieski); lub związki testowe (czerwone). Wykonano podwójne odczyty, a strzałka wskazuje związek hamujący zidentyfikowany jako 3-rutozyd kwercetyny. Każdy symbol reprezentuje indywidualny odczyt. (B) Wpływ wskazanych stężeń 3-rutynozyny kwercetyny na aktywność PDI, określony za pomocą testu redukcji insuliny (średnia . SD). (C) Sensorgram wiązania 3-rutozydu kwercetyny do rekombinowanego PDI. Cienka strzałka wskazuje czas wstrzyknięcia 3-rutynozydu kwercetyny na chip czujnikowy powleczony PDI, a gruba strzałka wskazuje czas wstrzyknięcia buforu regeneracyjnego. Czarne linie przedstawiają dopasowane krzywe dla duplikatów różnych stężeń analitu kwercetyna-3-rutozydu przy 0, 0,39, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25, 50 i 100. M. Figura 2 Związek strukturalny flawonoli i ich siła działania (IC50) hamowania PDI. Liczby w strukturze odpowiadają numerom w nagłówkach kolumn. Quercetin-3-rutinozyd jest selektywnym inhibitorem PDI. Zidentyfikowano kilka reduktaz tiolowych w komórkach naczyniowych i można je uwolnić do przestrzeni pozanaczyniowej. Aby ocenić selektywność 3-rutozydu kwercetyny dla PDI, określiliśmy jego aktywność względem innych oksydoreduktaz (1), o których wiadomo, że są wydzielane z płytek krwi lub komórek śródbłonka (17). 3-rutozyd kwercetyny nie hamował ERp5, ERp57, ERp72, tioredoksyny (Figura 3A) ani reduktazy tioredoksyny (Figura 3B). Te oksydoreduktazy dzielą się z PDI motywem CGHC z motywem aktywnym i wykazują aktywność reduktazy podobną do aktywności PDI. Jednak nawet przy 30. M, 3-rutozyd kwercetyny miał znikome hamowanie (~ 10%) innych oksydoreduktaz. Tak więc, 3-rutozyd kwercetyny wiąże się i odwracalnie hamuje PDI, ale wykazuje jedynie minimalną aktywność wobec innych pozakomórkowych izomeraz tiolowych obecnych w układzie naczyniowym. Figura 3Cuercetin-3-rutozyd selektywnie hamuje PDI. (A) Efekt 3-rutynozydu kwercetyny przy 0,3 .M (czerwony), 3 .M (niebieski) i 30 .M (zielony) na aktywności PDI, tioredoksyny (TRX), ERp5, ERp72 i ERp57, jak zmierzono w teście redukcji insuliny. Dane pokazują średnią i SD 3 niezależnych oznaczeń. (B) Oznaczenie reduktazy insuliny pod nieobecność (czarna) lub obecność (czerwona) 30. M kwercetyny-3-rutozydu oprócz tioredoksyny, reduktazy tioredoksyny i NADPH jako redukującego równoważnika. Analogi Quercetin-3-rutinozydowe jako inhibitory PDI. Zatłoczony 3-rutozyd kwercetyny jest hydrolizowany do kwercetyny w jelicie i dalej modyfikowany do innych skoniugowanych metabolitów kwercetyny (18). Oceniliśmy zdolność zwykłych metabolitów 3-rutynozyny kwercetyny i innych analogów do hamowania aktywności PDI. 3-glukuronid korkcetyny, jeden z licznych metabolitów kwercetyny-3-rutozydu stwierdzony w osoczu, wykazał IC50 5,9. M (3,5. 10,1. M, 95% przedział ufności). Isoquercetin, hyperoside i datiscin, z których wszystkie mają wiązanie 3-O-glikozydowe (Figura 2), również hamowały aktywność reduktazy PDI
[przypisy: 6 filarów poczucia własnej wartości pdf, beata rusin komornik, toksyczni rodzice chomikuj ]
[patrz też: remigiusz wierzgoń wikipedia, odziejsie, multimed zamość ]