Inhibitory izomeraz białkowych disiarczkowych stanowią nową klasę środków przeciwzakrzepowych ad 8

Agregację zredukowanych łańcuchów insuliny zmierzono przez absorpcję przy 650 nm. Wysoko przepustowy test przeprowadzono w 384-studzienkowym formacie płytki i objętości 30 ul w obecności 0,3 mM DTT, 60 nM PDI, 0,4 jjM insuliny i 2 mM EDTA w 100 mM fosforanu potasu, pH 7,4. w 25 ° C. Mieszanina reakcyjna do późniejszych oznaczeń redukcji insuliny zawierała 100 mM fosforanu potasu (pH 7,4), 0,75 mM DTT, 2 mM EDTA, 0,1 mM insuliny bydlęcej i 0,8 um oczyszczonego ludzkiego PDI w całkowitej objętości 135 ul w 96- dobrze płytka. Tioredoksynę-1 stosowano w stężeniu 3. M, podczas gdy ERp5, ERp57 i ERp72 wszystkie były stosowane przy 0,8. M. Postęp reakcji monitorowano przez 30 minut w 23 ° C. Korekcetin-3-rutozyd lub bufor kontrolny dodano przed dodaniem enzymu we wskazanych stężeniach. Aktywność PDI w obecności związku określono za pomocą następującego wzoru: aktywność PDI (%) = (OD [związek + PDI + DTT]. OD [DTT]) / (OD [PDI + DTT]. OD [DTT]) × 100%. Hamowanie enzymu określono za pomocą następującego wzoru: hamowanie enzymu = (l <[ODmax {związek + enzym} / ODmax {kontrola buforu + enzym}]). Wartości IC50 obliczono stosując nieliniową analizę regresji. Testy odwracalności przeprowadzono w sposób opisany w Dodatkowych metodach. Powierzchniowy rezonans plazmonowy. Interakcję między PDI a 3-rutozydem kwercetyny mierzono za pomocą systemu BIAcore T100 (GE Healthcare) stosując PBS zawierający 0,005% P20 (GE Healthcare) i 0,5% DMSO. PDI w 10 mM octanie sodu (pH 5,5) kowalencyjnie sprzężono z chipem CM5 za pomocą sprzęgania amin, zgodnie z instrukcjami producenta. Powierzchnia kontrolna uległa takiej samej aktywacji i dezaktywacji w przypadku braku PDI. Roztwór kercytyno-3-rutozydu w różnych stężeniach perfundowano przez unieruchomiony PDI z szybkością przepływu 95 .l na minutę przez 2 minuty, a następnie samym buforem i rejestrowano zmiany rezonansu. Sensorgram unieruchomionej kontrolnej powierzchni odjęto od powierzchni powleczonej PDI, a dane analizowano za pomocą oprogramowania BIAevaluation (BIAcore, GE Healthcare). Agregacja płytek. Umyte ludzkie płytki krwi (2 x 108 płytek krwi / ml w buforze Hepes-Tyrode, 134 mM fosforanu sodu, 2,9 mM KCl, 12 mM wodorowęglanu sodu, 20 mM HEPES, mM chlorku magnezu, 5 mM glukozy [pH 7,3]) inkubowano z wskazane stężenia 3-rutynozydu kwercetyny w PBS i 0,1% DMSO w 37 ° C przez 15 minut, a następnie eksponowane na agonistę AYPGKF o stężeniu 50 | jM PAR4. W celu zbadania płytek krwi myszom podano dożylnie 3-rutynozynę kwercetyny (0,5 mg / kg) lub sam nośnik. Pięć minut po infuzji, krew została pobrana przez nakłucie serca. Osocze bogate w płytki izolowano przez odwirowanie przy 200 g i oceniano pod kątem agregacji w odpowiedzi na 200. M AYPGKF. Agregację mierzono przy użyciu systemu Chrono-Log 680 Aggregation. Pobudzenie komórek śródbłonka i immunobarwienie. Komórki śródbłonka aktywowano laserem, jak opisano wcześniej (8, 47). Monowarstwy HUVEC hodowano na powlekanych żelatyną szkiełkach nakrywkowych o grubości 0,1% (Bellco Glass) aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Przed stymulacją laserem komórki śródbłonka obciążono Fluo-4. Komórki następnie zanurzono w odwapnionym osoczu uzupełnionym inhibitorem trypsyny kukurydzy (100 .g / ml, Hematologic Technologies) i swoistym przeciwciałem hamującym PDI, RL90 lub 3-rutynozyd kwercetyny w różnych stężeniach. Poszczególne komórki na wytrawionym szkiełku nakrywkowym aktywowano za pomocą systemu laserowego Micropoint i zarejestrowano mobilizację wapnia. Reakcję z osoczem zatrzymano po 15 minutach 20 mM EDTA, a komórki natychmiast utrwalono w 3% paraformaldehydzie przez 5 minut. Po utrwaleniu komórki przemyto PBS i wybarwiono przeciwciałem anty-fibrynowym (klon 59D8) lub dopasowanym izotypowo przeciwciałem kontrolnym. Obrazy zostały wykonane przy użyciu kamery Roper CoolSNAP HQ. Testy polimeryzacji fibryny katalizowanej trombiną przeprowadzono zgodnie z opisem w Dodatkowych metodach. Mikroskopia pod mikroskopem. Wewnątrzoczodową mikroskopię wideo mikrokrążenia mięśni Cremastera wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (22). Cyfrowe obrazy zostały przechwycone kamerą Cooke Sensicam CCD (The Cooke Corporation) podłączoną do VS4-1845 Image Intensifier GEN III (Video Scope International). Uszkodzenie wywołane laserem. Uszkodzenie ściany naczyń krwionośnych Cremaster arteriolar (o średnicy od 30 do 50 .m) indukowano za pomocą mikropunktowego systemu laserowego (instrumenty fotoniczne), skupionego przez obiektyw mikroskopu, parfokalnego z płaszczyzną ogniskową i dostosowanego do 440 nm przez komórkę barwnika zawierającą 5 mM kumaryna w metanolu (13). Dane uzyskano cyfrowo z 2 kanałów fluorescencyjnych, 488/520 nm i 647/670 nm [przypisy: klinika bocian białystok, apteka całodobowa bydgoszcz, toksyczni rodzice chomikuj ] [podobne: hydrokolonoterapia poznań, hydrokolonoterapia wrocław, raven market ]