Inhibitory izomeraz białkowych disiarczkowych stanowią nową klasę środków przeciwzakrzepowych ad 7

Zatem flawonole z wiązaniami 3-O-glikozydowymi mogą preferencyjnie kierować zewnątrzkomórkowe PDI. Stężenia osoczowe 3-rutozydu kwercetyny uzyskane po infuzji podczas badań tworzenia skrzeplin były znacznie niższe niż stężenia wymagane do hamowania PDI in vitro. Stężenia ketcety- tyno-3-rutozydu wykryte in vivo były również niższe niż te wymagane do hamowania agregacji płytek lub wytwarzania fibryny na komórkach śródbłonka. Kilka czynników ogranicza siłę wniosków, które można wyciągnąć z porównania wyników in vitro i in vivo. Najważniejszym z nich jest rozległy metabolizm 3-rutynozydu kwercetyny in vivo. Narażenie na działanie 3-rutozydu kwercetyny powoduje wytwarzanie ponad 60 metabolitów (35). Wiele głównych metabolitów, takich jak 3-glukuronid kwercetyny, ma wiązanie 3-O-glikozydowe i jest aktywne wobec PDI, co wykazano na podstawie zależności aktywności strukturalnej (Figura 2). Ponadto wiadomo, że rutynozydy wiążą się ze ścianą naczynia krwionośnego (36, 37), gdzie mogą utrzymywać aktywność przeciwzakrzepową, ale nie mogą być wykrywane w osoczu. Ograniczenie porównań między badaniami in vitro oczyszczonego PDI i badań in vivo polega na tym, że badania in vitro polegają na redukcji insuliny przez PDI, podczas gdy pozostałe substraty PDI podczas tworzenia skrzepliny in vivo pozostają do ustalenia. Zatem, o ile dane te są zgodne z możliwością, że 3-rutozyd kwercetyny jest silniejszy in vivo niż in vitro, trudno jest wyciągnąć jednoznaczne wnioski dotyczące takiego porównania. Quercetin-3-rutinozyd i inne flawonole związane z 3-O-glikozydem zidentyfikowane jako inhibitory PDI występują w wysokich stężeniach w herbacie, owocach, jagodach i gryku (38). W wielu badaniach wykazano, że przewlekłe podawanie dietetycznych flawonoli w stężeniach sięgających 3000 mg / kg nie wykazuje znaczącej toksyczności w badaniach na zwierzętach (39. 41). Dietetyczne flawonole stosowane w badaniach klinicznych również były dobrze tolerowane (41). Badania epidemiologiczne oceniające wpływ przyjmowania flawonolu na zdarzenia sercowo-naczyniowe wskazują na ochronę przed zawałem mięśnia sercowego i udarem ze zwiększonym poborem (42. 44). Podsumowując, identyfikujemy 3-rutozyd kwercetyny jako inhibitor PDI i wykazujemy, że hamowanie PDI silnie blokuje tworzenie skrzeplin in vivo. Obserwacje te dostarczają dowodów na zasadność kierowania zewnątrzkomórkowego PDI w celu zahamowania tworzenia się skrzepu. Inne środki, które hamują funkcję PDI, takie jak juniferdyna (14) lub bacytracyna (45), również hamują tworzenie zakrzepów in vivo (dane nie pokazane i odnośnik 7). Jednak środki te są cytotoksyczne lub nieselektywne (12, 14). Fakt, że kwercetyna-3-rutozyd jest przeciwzakrzepowy przy stężeniach flawonolu, które są dobrze tolerowane, w oparciu o obszerną literaturę kliniczną na zwierzętach i ludziach, wskazuje, że hamowanie zewnątrzkomórkowego PDI jest bezpieczną strategią hamowania tworzenia się skrzepliny. Farmakologiczna regulacja aktywności enzymatycznej PDI może zapobiec zakrzepicy w chorobie wieńcowej, udarze lub żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej. Metody Zwierzęta. Myszy C57BL / 6J otrzymano z The Jackson Laboratory. Przeciwciała i odczynniki. Przeciwciało przeciwpłytkowe Dylight 649 CD42b zakupiono od Emfret Analytics. Fluo-4 i białko G-Sepharose zakupiono od Invitrogen. Quercetin-3-rutinozyd, kwercetyna, izoquercetin, insulina i peptyd agonisty PAR4 AYPGKF zakupiono od Sigma-Aldrich. Quercetin-3-glukuronid pochodzi z ekstrasynthezy. Wszystkie inne flawonole zakupiono od Chromadexu. Przeciwciało anty-PDI RL90 i rekombinowane białko ERp57 pochodziło od Abcam, ERp72 pochodziło od Enzo Life Sciences, a tioredoksyno-1 pochodziło z R & D Systems. HUVEC i ośrodek wzrostu EBM-2 i suplementy zakupiono od Lonza. Izolacja białka. Ludzki rekombinowany znakowany His PBI został wklonowany do wektora pET-15b i transformowany do E. coli Origami B (DE3) (EMD Chemicals). ERp5 wklonowano do wektora pET-15b i transformowano do E. coli Origami 2 (DE3) (EMD Chemicals). Rekombinowane białka były rozpuszczalne i izolowane za pomocą chromatografii powinowactwa z kolumną Ni-NTA (Qiagen) dla PDI i chromatografii powinowactwa na kobalcie (Pierce Biotechnology) dla ERp5. PDI został dodatkowo oczyszczony przez filtrację żelową w Superdex 200 (GE Healthcare). Mysie monoklonalne przeciwciało przeciw ludzkiemu fibrynowemu II (3 oczyszczono z białka G-Sepharose (Invitrogen) z linii komórkowej hybrydom 59D8 (46) i wyznakowano Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Test redukcji insuliny. Aktywność reduktazy badano przez pomiar PDI lub innej katalizowanej przez tiol izomerazę redukcji insuliny w obecności DTT.
[patrz też: apteka całodobowa bydgoszcz, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, opieka na członka rodziny ]
[podobne: mazak gostyń, protruzja krążka, hydrokolonoterapia warszawa ]