Ets-1 jest krytycznym regulatorem zapalenia i przebudowy naczyń krwionośnych Ang II czesc 4

Sugeruje to, że KLF5 znajduje się powyżej Ets-1 lub indukowane niezależnie od Ets-1 w odpowiedzi na Ang II. Figura 4 Immunohistochemiczne barwienie PAI-1, p21CIP, VCAM-1 i MCP-1 w aorcie piersiowej Ets1 + / + i Ets1 (3 /. myszy po wlewie Ang II. Ocena ekspresji PAI-1, inhibitora kinazy zależnej od cyklin p21CIP, VCAM-1 i MCP-1 po tygodniu wlewu Ang II (1,4 mg / kg / dzień) w aorcie piersiowej Ets1 + / + w porównaniu z Ets1. /. myszy. Dopasowane izotypowo kontrole są pokazane poniżej każdego panelu. Oryginalne powiększenie, × 100; powiększone regiony, × 400. Figura 5 Immunohistochemiczne barwienie KLF5, tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i IL-6 w aorcie piersiowej Ets1 + / + i Ets1 (3 /. myszy po infuzji Ang II (1,4 mg / kg / dobę) przez tydzień. Oryginalne powiększenie, × 200. Dopasowane izotypowo kontrole są pokazane poniżej każdego panelu. Regulacja genu MCP-1 przez Ets-1. Zgodnie z naszą wiedzą rola Ets-1 w regulacji genu MCP-1 nie została wcześniej wykazana. Analiza sekwencji nukleotydowej proksymalnego ludzkiego promotora MCP-1 ujawniła 11 przypuszczalnych miejsc wiązania Ets-1 (3 (Figura 6A). W związku z tym przeprowadziliśmy badania transaktywacji w testach SMC na szczurach aortalnych (RASMC) z panelem czynników Ets, w tym Ets-1, Ets-2, NERF1A, NERF2 i ELF-1. Z panelu testowanych czynników Ets, Ets-1 był najsilniejszym transaktywatorem promotora MCP-1, prowadząc do 10-krotnego wzrostu aktywności lucyferazy w porównaniu z pustym wektorem ekspresyjnym (Figura 6B). Test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przeprowadzono w celu zbadania, czy Ets-1 wiąże się ze specyficznymi miejscami Ets w obrębie promotora MCP-1 w ludzkich aortalnych SMC (HASMC) stymulowanych Ang II. Do testu ChIP zaprojektowano startery PCR flankujące 4 regiony w obrębie promotora MCP-1 (Figura 6A). Usieciowane kompleksy białko / DNA poddano immunoprecypitacji z HASMC hodowanych w obecności Ang II przez 2 i 4 godziny, z króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciwko Ets-1. Analiza PCR ujawniła 2 regiony (ChIP2 i ChIP4) odpowiadające miejscu 402 Ets i miejscom 2,003,> 2,078 i <2,253 (Figura 6A), które były immunoprecypitowane przez przeciwciało Ets-1, podczas gdy regiony ChIP i 3 nie były (Figura 6C). Spośród miejsc wiążących 4 Ets w obrębie regionów ChIP 2 i 4, zidentyfikowaliśmy 2 miejsca o wysokim powinowactwie (. 2,253 i. 402) do wiązania z Ets-1 w HASMC stymulowanych Ang II stosując test przesunięcia ruchliwości żelu. Przedstawiono wyniki reprezentatywnego testu przesunięcia ruchliwości żelu przy użyciu sondy oligonukleotydowej kodującej miejsce wiążące Ets-1 zlokalizowane przy> 2,253 (Figura 6D). Podczas gdy zaobserwowano jedynie słabe wiązanie Ets-1 do tego miejsca w niestymulowanych komórkach (linia 1), obserwowano zależny od czasu wzrost wiązania Ets-1, z maksymalnym wiązaniem 4 godziny po stymulacji Ang II i słabszym resztkowym wiązaniem przy 16 godziny. Swoistość kompleksu utworzonego po 4 godzinach została potwierdzona przez fakt, że 10 ng nieznakowanego (zimnego) oligonukleotydu było zdolne do silnego konkurowania ze znakowaną sondą (ścieżka 6). Ponadto, gdy zmutowany oligonukleotyd, w którym motyw rdzenia Ets został zmutowany, został użyty jako konkurent, nie zaobserwowano zmiany wiązania (ścieżka 7). Przeciwciało poliklonalne skierowane przeciwko Ets-1 całkowicie zahamowało tworzenie kompleksu (ścieżka 8), podczas gdy kontrola z dopasowaniem izotypowym nie przynosiła efektu (ścieżka 9). Trzy konstrukty delecyjne, A, B i C (Figura 6, A i E) i mutacje miejsc wiążących Ets-1 zlokalizowanych przy A2253 (M1) i przy 402 (M2) użyto do oceny względnego znaczenia tych Wiązania Ets i regiony promotora MCP-1 w odniesieniu do indukcji promotora przez Ang II w RASMC (Figura 6E). Konstrukty delecyjne potwierdzają znaczenie 2 regionów, pomiędzy a 2363 i A 970 i między 417 a 176, dla indukcji Ang II. Co ciekawe, regiony te obejmują 2 wiążące regiony Ets-1 (3 o wysokim powinowactwie (ChIP2 i ChIP4) zidentyfikowane przez analizę ChIP. Ponadto mutant miejsca M1 doprowadził do zmniejszenia transaktywacji Ang II z 4,7 do 2,7 razy; podobnie dla mutanta M2 i podwójnego mutanta (M1 + M2), które zredukowano odpowiednio do 3,2- i 2,1-krotnego. Obserwowano podobne redukcje w odniesieniu do transaktywacji Ets-1 promotora MCP-1, z maksymalną redukcją od 10-krotnej do 5,5-krotnej z M1 + M2, co pokazuje, że te 2 miejsca wiązania Ets-1 (3 są funkcjonalnie ważne dla transaktywacja promotora MCP-1 przez Ets-1 (Figura 6F). Figura 6Rozpoznawanie ludzkiego genu MCP-1 przez Ets-1. (A) Schemat ludzkiego promotora MCP-1 z przypuszczalnymi miejscami wiązania Ets-1 (wypełnione kółka). Miejsce rozpoczęcia transkrypcji wskazano strzałką w prawo, a konstrukty delecyjne MCP-1 oznaczono jako A, B i C
[więcej w: apteka całodobowa bydgoszcz, komornik beata rusin, toksyczni rodzice chomikuj ]
[podobne: engerix b cena, remigiusz wierzgoń wikipedia, odziejsie ]