Ets-1 jest krytycznym regulatorem zapalenia i przebudowy naczyń krwionośnych Ang II ad 8

Ciśnienie krwi mierzono 0, 3, 7 i 14 dni po wlewie angiotensyny. Myszy ważono w wieku 21 dni i 8 tygodni oraz w czasie każdego pomiaru ciśnienia krwi. Izolacja RNA, ilościowy RT-PCR i genotypowanie. RNA z aorty myszy C57BL / 6 homogenizowano przy użyciu Tissue-Tearor (model 985370, BioSpec Products Inc.) i izolowano przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (QIAGEN) z zestawem DNazy wolnym od RNazy (QIAGEN) w celu usunięcia genomowego DNA. RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu startera oligo-dT i polimerazy SuperScript II RT (Invitrogen Corp.). Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym została przeprowadzona przy użyciu detektora sekwencji ABI PRISM 7700 (TaqMan; Applied Biosystems) w połączeniu z barwnikiem SYBR Green (Invitrogen Corp.). Ekspresję Ets-1 analizowano przy użyciu GAPDH jako kontroli wewnętrznej. Początkowy etap denaturacji prowadzono przez 10 minut w 95 ° C, a następnie poddawano amplifikacji przez 40 cykli, stosując warunki panujące w każdym cyklu: 30 sekund w 95 ° C, 30 sekund w 58 ° C i minuta w 72 ° C. Zastosowano następujące startery: Ets-1, 5 (3 -AGTGGACAGAAACCCATGTT (do przodu), 5 (3 -CAAAGTCTGGGGCCAGCT (wsteczny); GAPDH, 5a-CAAAGTTGTCATGGATGACC (do przodu), 5a -CCATGGAGAAGGCTGGGG (wsteczny). Sekwencja starterów stosowanych do fenotypowania Ets1 + / + i Ets1. /. myszy były następujące: 5. -ATTGAACAAGATGGATTGCAC-3. (NeoA); 5. -TTCGTCCAGATCATCCTGATCGAC-3. (NeoB); 5. -GCTAGATGAGGGAGGAAG-3. (EtsF); i 5a-CCAACAAAGTCTGGAGCC-3. (EtsR). RT-PCR przeprowadzono przez 30 cykli w następujących warunkach dla każdego cyklu: minuta w 94 ° C, minuta w 55 ° C i minuta w 72 ° C, a następnie 7 minut w 72 ° C. Pięć mikrolitrów produktu amplifikacji analizowano na 2% żelu agarozowym. Pomiary syntezy białek. W celu pomiaru syntezy białek, hodowane SMC w 12-studzienkowych płytkach stymulowano Ang II przez 18 godzin i pulsowano .l / studzienkę [3H] leucyny przez 6 godzin. Następnie komórki przemyto dwukrotnie lodowatą PBS, inkubowano przez 5 minut w 10% kwasie trichlorooctowym na lodzie, przemyto 99% etanolem i rozpuszczono w 0,5 N NaOH. Włączenie [3H] leucyny do materiału nierozpuszczalnego w kwasie trichlorooctowym zmierzono za pomocą ciekłego spektrofotometru scyntylacyjnego. Pomiar syntezy DNA. SMC w 6-studzienkowych płytach stymulowano Ang II przez 18 godzin i pulsowano .C / ml [3H] tymidyny przez 5 godzin. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS, inkubowano przez 5 minut w 5% kwasie trójchlorooctowym, przemyto metanolem i rozpuszczono w 99% kwasie mrówkowym. Włączenie [3H] tymidyny do materiału nierozpuszczalnego w kwasie trichlorooctowym zmierzono za pomocą ciekłego spektrofotometru scyntylacyjnego. Wektor ekspresyjny i konstrukt genu reportera lucyferazy. Fragment o długości 2539 pz odpowiadający nukleotydom a 2363 do +176 ludzkiego promotora MCP-1 sklonowano z ludzkiego genomowego DNA metodą PCR i subklonowano do wektora reporterowego pGL2 lucyferazy (Promega). Fragment o długości 2539 pz wstawiono w miejsce Kpn-Hindlll powyżej genu lucyferazy wektora pGL2. Komplementarne sekwencje DNA kodujące panel czynników Ets subklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pCI (Promega). Testy transfekcji DNA. Kotransfekcję 2 x 105 RASMC przeprowadzono z użyciem 0,3 .g DNA konstruktu genu reporterowego i 0,15 .g DNA wektora ekspresyjnego przy użyciu 4 .l lipofektaminy (Invitrogen Corp.), jak opisano wcześniej (62). Komórki zebrano 16 godzin po transfekcji i oznaczono aktywność lucyferazy. Transfekcje dla każdego konstruktu przeprowadzono niezależnie w dwóch powtórzeniach. Nie wykryto kotransfekcji drugiego plazmidu w celu określenia skuteczności transfekcji, ponieważ doniesiono o potencjalnych artefaktach za pomocą tej techniki, a ponieważ wiele powszechnie stosowanych promotorów wirusowych zawiera potencjalne miejsca wiązania dla czynników Ets (63). Mutageneza ukierunkowana. Mutagenezę ukierunkowaną promotora MCP-1 przeprowadzono za pomocą zestawu do szybkiej mutagenezy QuickChange (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. PCR przeprowadzono z użyciem polimerazy Pfu Turbo (Stratagene), stosując jako matrycę konstrukt reportera lucyferazy promotora MCP-. (. 2,363 do +176). Starter PCR kodujący promotor MCP-1 dla zmutowanego miejsca Ets przy 23253 z rdzeniem GGAT zmutowanym do CTAT był 5. -CATGCCACACTATGTCTATA-3. i dla miejsca Ets przy. 402 z TTCC zmutowanym do TATC było 5. -AGAGCTCCTATCTGGCTGGGAGGC-3 .. Reakcję PCR strawiono DpnI, a niestrawione plazmidy przekształcono w DH5a. bakteria. Poszczególne miniprekty zsekwencjonowano w celu potwierdzenia włączenia mutacji miejsca Ets. Zmutowany promotor MCP-1 z 402 został użyty jako matryca do wygenerowania podwójnego mutanta. 2253, a402. Analiza ChIP
[hasła pokrewne: sanatorium krystyna busko, toksyczni rodzice chomikuj, wyparzanie słoików w piekarniku ]
[więcej w: komornik beata rusin, beata rusin komornik, komornik sądowy beata rusin ]