Ets-1 jest krytycznym regulatorem zapalenia i przebudowy naczyń krwionośnych Ang II ad 7

Protokoły badań na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komisje zajmujące się opieką nad zwierzętami i ich używaniem w Centrum Medycznym Diakoness Beth Israel. Ets1. /. Myszy wytworzono przez wstrzyknięcie komórek ES ESS-1 (3 z niedoborem Ets-1 (3 do blastocyst C57BL / 6 w celu wytworzenia chimer, a samice heterozygotyczne hodowano z samicami C57BL / 6 jak opisano wcześniej (58, 59). Myszy przenoszono dalej 6-krotnie wstecznie na tło C57BL / 6 przed rozpoczęciem eksperymentów z Ang II. Genotypowanie przeprowadzono przez PCR genomowego DNA wyizolowanego z mysich ogonków. PCR przeprowadzono jak opisano poniżej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono przy użyciu męskiego Ets1. /. myszy z miotowymi kontrolami Ets1 + / +. Dla każdego eksperymentu przygotowano co najmniej 5 par. Myszy znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny (5 mg / kg) i ketaminy (80 mg / kg). Minipompę ALZET (modele 1007D i 1002, DURECT) zawierającą 1,4 mg / kg / dzień Ang II (A-9525, Sigma-Aldrich) rozpuszczoną w soli fizjologicznej lub samej solance (leczenie pozorowane) wszczepiono podskórnie. Po uśmierceniu zwierząt klatkę piersiową otwarto, igłę o średnicy 21 umieszczono w lewej komorze, a żyły dolnej dolnej odcięto. Zwierzęta perfundowano normalną solą fizjologiczną, aż perfuzat się oczyścił, a następnie 4% paraformaldehydem przy 100 mm Hg. Analiza morfometryczna. Tkanki zatopiono w parafinie i pocięto na sekcje o wielkości 5. M. Skrawki wybarwiono barwieniem Trichrome Massona, aby umożliwić wykrycie zwłóknienia okołonaczyniowego. Średni pogrubienie i zwłóknienie okołonaczyniowe oceniano jak opisano wcześniej (49, 60, 61). W skrócie, stosunek powierzchni środkowej przekroju poprzecznego do powierzchni luminalnej zastosowano jako wskaźnik zagęszczenia tętniczego. Mierzono również absolutną grubość przyśrodkową. Złamanie okołonaczyniowe określono przez obliczenie stosunku obszaru zwłóknienia wokół naczynia, mierzonego przez obszar niebieskiego zabarwienia (odkładanie kolagenu zabarwione błękitem anilinowym) natychmiast wokół naczynia, do całkowitej powierzchni naczynia. Mierzono również grubość obszaru włóknistego otaczającego naczynie. Pomiary przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (NIH Image, wersja 1.62, http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). Dla każdego pomiaru oceniano trzy niezależne skrawki na tętnicę myszy z niedoborem 5 Ets-1 (3 i ich kontrolnych z miotu. Immunohistochemia. Skrawki (5 .M) wycięte z aorty, serca lub tkanek zatopionych w parafinie wykorzystano do barwienia immunohistochemicznego. Skrawki poddano deparafinizacji i ponownie uwodniono, a następnie zastosowano odzysk mikrofalowy w 10 mM Tris EDTA (pH 7,5) w 93 ° C przez 5 minut. Badano trzy niezależne skrawki na tętnicę złożoną z 5 par myszy (Ets1 + / + i Ets1 (3 / b). Pierwotne przeciwciała użyte w badaniu były następujące: królicze antyludzkie Ets-1 (N-276) (1: 500, sc-111, Santa Cruz Biotechnology Inc.), królicze antyludzkie PAI-1 (1: 2000 , sc-8979, Santa Cruz Biotechnology Inc.), królicze anty-ludzkie p21CIP (1: 2000, sc-12902, Santa Cruz Biotechnology Inc.), kozie anty-szczurze MCP-1 (1: 1000, sc-1785, Santa Cruz Biotechnology Inc.), króliczego anty-ludzkiego CD3 (kod A 0452; DakoCytomation), frakcji króliczej IgG jako kontroli negatywnej dla CD3 (kod X 0936; DakoCytomation), szczurzego anty-mysz Mac3 (1:10; katalog 550292, BD Biosciences Pharmingen), szczurzą IgG1 jako kontrolę ujemną dla Mac3 (katalog 559072, BD Biosciences. Pharmingen), królicze przeciwciało przeciw KLF5 myszy (1: 1000, PAB-11411, Orbigen Inc.), królicze przeciwludzkie VCAM-1 (1: 500, sc-8304, Santa Cruz Biotechnology Inc.), kozie anty-mysia IL-6 (1: 500, sc-1265, Santa Cruz Biotechnology Inc.), królicze przeciw-ludzkie tPA (1: 500; sc-15346, Santa Cruz Biotechnology Inc.), normalne kozie IgG jako kontrola negatywna dla przeciwciała koziego (sc-2028; Santa Cruz Biotechnology Inc.), normalne królicze IgG jako kontrola negatywna dla przeciwciała królika (sc-2027; Santa Cruz Biotechnology Inc.). Do barwienia immunohistochemicznego zastosowano zestawy VECTASTAIN Elite ABC (PK-6105 kozie IgG i PK-6101 królicze IgG, Vector Laboratories). Skrawki wybarwiono kontrastowo za pomocą zieleni metylowej (S1962; DakoCytomation). Obserwowano leukocyty CD3-dodatnie i makrofagi Mac3-dodatnie w 3 niezależnych przekrojach na tętnicę 5 par myszy. Liczbę komórek, które wybarwiono pozytywem wyrażono jako procent całkowitej liczby komórek. Pomiar ciśnienia krwi. System pomiaru ciśnienia krwi BP-2000 (Visitech Systems Inc.) został wykorzystany do pomiaru ciśnienia krwi myszy w warunkach zalecanych przez producenta. Aby wyszkolić myszy, wykonaliśmy codzienne pomiary ciśnienia krwi przez tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów. Myszy umieszczono w maszynie w 37 ° C na 10 minut i pozostawiono do osiągnięcia równowagi przed pomiarem ciśnienia krwi
[więcej w: fenistil ulotka, protruzja krążka międzykręgowego, galareta wieprzowa kalorie ]
[przypisy: fenistil ulotka, supradyn opinie, szpital psychiatryczny toszek ]