Docelowa szczepionka DNA kodująca ligand Fas określa podwójną rolę w regulacji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia czesc 4

Zatem odpowiedź autoimmunologiczna po podaniu szczepionki nagiego DNA in vitro FasL prowadzi do wyraźnego zmniejszenia objawów choroby. Nie można było zaobserwować żadnej różnicy między odpowiedzią proliferacyjną komórek T pP47-86 specyficzną dla limfocytów T rozwiniętą w drenujących komórkach węzłów chłonnych (DLNC) szczurów poddanych szczepieniu DNA FasL i tych, którym podawano sam wektor pcDNA3 (dzień 9 choroby, SI = 3,8 . 0,3 w porównaniu z 3,6. 0,4). Tak więc, hamowanie EAE u szczurów zaszczepionych DNA FasL (Figura 1) nie mogło być wyjaśnione przez zmniejszenie specyficznej dla antygenu odpowiedzi komórek T. Ryc. 1. Kierowanie działalnością FasL przez samoistnie nagi DNA poprawia EAE. Szczury immunizowano co tydzień klonowanymi produktami PCR fasL zligowanymi z eukariotycznym wektorem ekspresyjnym pcDNA3, z samym wektorem pcDNA3 lub z PBS. Dwa miesiące po ostatniej immunizacji, wszystkie szczury immunizowano p68-86 / CFA w celu indukcji aktywnego EAE i monitorowano pod kątem klinicznych objawów codziennie przez obserwatora niewidomego w protokole leczenia. Wyniki przedstawiono jako średnią ocenę kliniczną sześciu szczurów na grupę. SE. Szczepionka DNA kodująca FasL indukuje rozkład tolerancji na swój produkt genowy i wytwarza odporność na natywną FasL związaną z błoną. Szczepienie DNA może potencjalnie wywoływać zarówno odpowiedzi komórkowe jak i humoralne przeciw produktom danego konstruktu. W celu ustalenia, czy podanie szczepionek FasL-DNA prowadzi do rozpadu tolerancji na siebie, szczury Lewisa poddano czterotygodniowym wstrzyknięciom konstruktu FasL-DNA, jak opisano na Figurze 1. Dwa miesiące po ostatniej immunizacji, gdy FasL-specyficzne Miano zachowało poziom podstawowy, szczury te, a szczury leczone samym pcDNA3 lub PBS, wstrzyknięto p68-86 / CFA w celu indukcji aktywnego EAE. Reprezentatywne szczury z każdej grupy wstrzyknięto sam CFA. W różnych punktach czasowych badano surowicę krwi i SCF od reprezentatywnych szczurów pod kątem obecności Abl na FasL. Wywołane miano powyższego produktu genu zaobserwowano zarówno w surowicy krwi, jak i SCF szczurów zaszczepionych FasL DNA. 8 dni po indukcji choroby. To miano osiągnęło maksymalny poziom w dniu 13 (Figura 2a, P <0,001 dla kompresji miana log2 Ab dla każdej grupy kontrolnej w porównaniu z odpowiednim szczurem zaszczepionym DNA FasL). Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że szczepienie nagim DNA FasL prowadzi do rozpadu tolerancji immunologicznej, co skutkuje wytworzeniem pamięci immunologicznej, która jest włączana po indukcji EAE (Figura 2a). Samo szczepienie CFA znacznie zwiększyło produkcję swoistych Ab do FasL u szczurów szczepionych DNA (P <0,01), chociaż w znacznie mniejszym stopniu niż indukcja aktywnej choroby. Immunologiczne podstawy tych różnic nie są jeszcze w pełni zrozumiałe i omówiono je poniżej. Fig. 2 Abs specyficzne dla FasL wytworzone na szczurach szczepionych DNA wiążą natywną FasL. Szczury Lewis poddawano czterotygodniowym wstrzyknięciom konstruktu DNA FasL, jak opisano na Figurze 1. Dwa miesiące po ostatniej immunizacji, gdy miano Ab specyficzne dla FasL zachowało linię podstawową, szczury te, jak również szczury traktowane samym pcDNA3 lub PBS, którym wstrzyknięto p68-86 / CFA w celu indukcji aktywnego EAE i uśmiercono w różnych punktach czasowych. Surowicę krwi i SCF od tych szczurów analizowano pod kątem obecności Abl na FasL. (a) Miana Log2 Ab określone na początku choroby (dzień 13). Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech próbek od różnych szczurów. SE. (b) Białka błon osoczowych uzyskano z nieaktywowanych (śledzonych c) lub 24-godzinnych aktywowanych (pasy a, b i d) śledzionowych limfocytów T. Wykorzystano SDS-PAGE w warunkach redukujących w celu oddzielenia białek błonowych, które następnie poddano analizie Western blot przy użyciu dostępnego w handlu (patrz metody) Ab (pasmo a), oczyszczone Aby otrzymane przez nagie szczepienie DNA (ścieżki) b i c) lub kontrolować IgG z normalnej surowicy szczurzej (ścieżka d). (c i d) Wiązanie swoistego anty-FasL uzyskanego przez szczepienie nagim DNA z ich receptorem docelowym (FasL związanym z błoną) określono za pomocą analizy cytometrii przepływowej na aktywowanych komórkach T specyficznych dla MBP (c) i otrzewnej wywołanej tioglikolanem. makrofagi (d). Następnie ustaliliśmy, czy powyższe swoiste swoiste Ab wiążą natywną FasL. Białka błon osoczowych otrzymano z nieaktywowanych (Figura 2b, ścieżka c) lub z 24-godzinnej aktywacji (Figura 2b, ścieżki a, b, i d) śledzionowych limfocytów T. Analiza Western blot wykazała, że zarówno dostępne komercyjnie Ab i te wywołane przez szczepienie DNA wiązały się z białkiem 40 kDa, które odpowiada natywnej błonowej FasL (Figura 2b, ścieżki aib). Wiązanie było ograniczone do aktywowanych komórek T (Figura 2b, ścieżka b kontra [patrz też: taksidi club, komornik sądowy beata rusin, galareta wieprzowa kalorie ] [przypisy: komornik beata rusin, beata rusin komornik, komornik sądowy beata rusin ]