Docelowa szczepionka DNA kodująca ligand Fas określa podwójną rolę w regulacji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia cd

Komórki następnie przemyto trzy razy i inkubowano (4 ° C, 0,5 godziny) z 50. L buforu FACS uzupełnionego kozim anty-szczurzym IgG-FITC (F6258, rozcieńczenie 1: 10000, Sigma Chemical Co.). Komórki następnie przemyto dwukrotnie i analizowano w obecności jodku propidyny (PI) stosując FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornia, USA). Zebrano dane dla 10 000 zdarzeń i analizowano za pomocą programu Cell Quest (Becton Dickinson). Oznaczanie cytokin w hodowanych pierwotnych komórkach śledziony. Komórki śledziony od dawców EAE stymulowano in vitro (107 komórek / ml) w 24-studzienkowych płytkach (Nunc) z 100. M p68-86. Po 72 godzinach stymulacji supernatanty badano pod kątem poziomu białka różnych cytokin przy użyciu dostępnych handlowo zestawów ELISA, które wymieniono w innym miejscu (13, 29). Pomiar produkcji TNF przez aktywowane makrofagi. Poziomy TNF-a w supernatantach makrofagów oznaczono jak opisano wcześniej (30). Pokrótce, makrofagi otrzewnowe wywołane tioglikolanem naniesiono na płytki 96 U w stężeniu 5 x 105 komórek / studzienkę i inkubowano w obecności .g / ml LPS (Salmonella enteritidis, L6011, Sigma Chemical Co.) w 37 ° C. ° C, 5% CO2, przez 24 godziny. TNF-. poziomy określano przy użyciu komercyjnego zestawu pół-ELISA (Genzyme, Cambridge, Massachusetts, USA). Histopatologia i immunohistochemia. Przeprowadzono histologiczne badania wybarwionych hematoksyliną i eozyną skrawków utrwalonych w formalinie zatopionych w parafinie odcinków dolnej części odcinka piersiowego i lędźwiowego rdzenia kręgowego. Każda sekcja została oceniona bez wiedzy o statusie leczenia zwierzęcia. Zastosowano następującą skalę: 0, bez infiltracji komórek jednojądrzastych; 1, od jednego do pięciu zmian okołonaczyniowych na sekcję z minimalnym naciekiem miękiszowym; 2, pięć do dziesięciu zmian okołonaczyniowych na sekcję z naciekiem miękiszowym; i 3, więcej niż dziesięć zmian okołonaczyniowych na sekcję z rozległym naciekaniem miąższowym. Średni wynik histologiczny plus lub minus SE obliczono dla każdej grupy leczenia. Ocenę immunohistochemiczną przeprowadzono na zamrożonych odcinkach dolnych odcinków piersiowych i lędźwiowych rdzenia kręgowego, jak opisał J. Westermann (31). Ab stosowane do barwienia komórek były następujące: monocyty, ED1; Komórki T, R73; Komórki B, His14; Komórki NK, 3.2.3; i neutrofile, RP1 (31). Test apoptozy in situ i histomorfometryczne oznaczanie. Pozytywnych komórek znakowania nici-końcowych dUTP. Terminalnych deoksynukleotydylowej transferazy. Dostępny komercyjnie terminalny, oparty na deoksynukleotydylowej transferotransferazie (TdT-mediowany) zestaw do oznaczania końca nicki dUTP (TUNEL) (Boehringer Mannheim, Ottweiler, Niemcy) został wykorzystany do oceny zakresu i lokalizacji apoptozy in situ, jak to szczegółowo opisano gdzie indziej (32). ). Histomorfometryczne oznaczenie komórek TUNEL-dodatnich wykonano przy użyciu systemu do analizy obrazu Olympus Cue-2 z odpowiednim oprogramowaniem morfometrycznym (Olympus, Lake Success, New York, USA). Pomiary przeprowadzono w standardowych polach o powierzchni 500 000 m2. W każdej grupie eksperymentalnej analizowano dziewięć odcinków z trzech różnych rdzeni kręgowych (dwa pola w każdej sekcji). Wyniki przedstawiono jako średnią z 18 próbek. SE. Zastosowano podwójnie zabarwioną analizę immunohistologiczną w celu scharakteryzowania komórek apoptotycznych TUNEL w następujący sposób: Ab 8-18C5 skierowany przeciwko glikoproteinie oligodendrologicznej (dostarczonej przez C. Liningtona, Max-Planck Institute, Monachium, Niemcy) zastosowano do barwienia oligodendrocytów (33). . Różne podtypy leukocytów barwiono przy użyciu markerów powierzchni komórki, jak opisano powyżej. Analiza statystyczna. Istotność różnic zbadano za pomocą testu ucznia. Test sumy rang Manna-Whitneya wykorzystano do oceny istotności różnic w średniej maksymalnej punktacji klinicznej. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za istotne. Wyniki Szczepionka DNA kodująca FasL blokuje rozwój EAE. Szczurom poddawano cztery cotygodniowe iniekcje szczepionek DNA kodujących FasL. Szczurom kontrolnym wstrzyknięto sam wektor pcDNA3 lub z PBS. Dwa miesiące po ostatniej immunizacji wszystkie szczury immunizowano p68-86 / CFA w celu indukcji aktywnego EAE. Wszystkie kontrolne (immunizowane PBS) i szczury zaszczepione pcDNA3 rozwinęły czynną chorobę, która utrzymywała się przez 5. 6 dni (Figura 1; sześć z sześciu w każdej grupie z maksymalnym wynikiem klinicznym 2,83. 0,18 w kontroli i 2,33. 0,23 u immunizowanych pcDNA. szczury). W przeciwieństwie do tego, szczury, którym wstrzyknięto szczepionkę nagiego DNA FasL miały znacznie zmniejszony stopień choroby (Figura 1, częstość występowania sześciu z sześciu z maksymalnym wynikiem klinicznym 1,16. 0,18, P <0,016 i P <0,0002 dla porównania tego. leczenie samym pcDNA3 lub PBS) [więcej w: galareta wieprzowa kalorie, 6 filarów poczucia własnej wartości pdf, szpital psychiatryczny toszek ] [podobne: fenistil ulotka, supradyn opinie, szpital psychiatryczny toszek ]