Docelowa szczepionka DNA kodująca ligand Fas określa podwójną rolę w regulacji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia ad

Mielinowe białko podstawowe (MBP) p68-86, YGSLPQKSQRSQDENPV, zostało zsyntetyzowane i oczyszczone, jak opisano w innym miejscu. W naszym badaniu wykorzystano jedynie peptydy o czystości większej niż 95%. Immunizacje i indukcja aktywnej choroby. Aktywny EAE indukowano, jak opisano w innym miejscu (13). Szczury były następnie monitorowane codziennie pod kątem objawów klinicznych przez obserwatora niewidomego w protokole leczenia. EAE oceniono w następujący sposób: 0, klinicznie prawidłowy; 1, zwiotczały ogon; 2, porażenie kończyny tylnej; 3, całkowite porażenie kończyny tylnej, któremu towarzyszy wyraźny paraliż przedniej kończyny; 4, całkowite porażenie kończyny tylnej i przedniej kończyny. Linie komórek T i indukcja przeniesionego EAE. Linię komórek T p68-86 MBP wybrano tak, jak to opisano w innym miejscu (25). Przeniesiony EAE indukowano przez immunizację szczurów Lewisa dootrzewnowo 107 komórkami T aktywowanymi in vitro (dzień 3) z linii encefalitogennej L68-86. EAE oceniano jak opisano powyżej. Produkcja konstruktu FasL i szczepienie DNA. Najpierw zastosowano analizę RT-PCR na próbkach mózgu zgodnie z protokołem opisanym gdzie indziej (25). Protezy oligonukleotydowe specyficzne wobec FasL zaprojektowano w oparciu o opublikowaną sekwencję (numer dostępu NCBI U03470) w następujący sposób: ligand szczurza Fas ligand 5. -CATGCAGCAGCCCGTGAATTACCC-3., Ligand szczurza Fas antysensowny 5a-TTAAAGCTTATATAAGCCAAAAAAGGT-3 .. Po klonowaniu i sekwencjonowaniu produktów PCR (25), cDNA kodujący ligand szczurza Fas przeniesiono do wektora pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, California, USA) i zastosowano jako konstrukt do szczepienia DNA, jak opisano w innym miejscu (25). Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanej FasL. Produkt PCR FasL reklonowano w wektorze ekspresyjnym pQE, ekspresjonowanym w Escherichia coli (QIAGEN, Chatsworth, Kalifornia, USA), a następnie oczyszczono przez oczyszczanie przez powinowactwo NI-NTA kolonii 6 x białek His (QIAGEN). Po oczyszczeniu czystość rekombinowanej FasL sprawdzono za pomocą elektroforezy żelowej. Sekwencję rekombinowanego białka zweryfikowano (koniec NH2) za pomocą naszej jednostki usług sekwencjonowania. Ocena miana Ab liganda anty-FAS w surowicy i płynie rdzenia kręgowego szczurów szczepionych DNA. Bezpośredni test ELISA zastosowano do oznaczenia miana Ab przeciwciała anty-Fas w surowicy i płynu rdzenia kręgowego (SCF) od szczurów zaszczepionych DNA. SCF uzyskano jak opisano szczegółowo w innym miejscu (26). Rekombinowany ligand Fas, który wytworzyliśmy, naniesiono na 96-studzienkowe płytki ELISA (Nunc, Roskilde, Dania) w stężeniach 50 ng / studzienkę. Przeciwciała przeciwko szczurzej, w seryjnych rozcieńczeniach od 28 do 230, dodano do płytek ELISA. Do oznaczenia Ab użyto kozie anty-szczurzą IgG sprzężoną z fosfatazą alkaliczną (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) i fosforan p-nitrofenylu (p-NPP) (Sigma Chemical Co.) stosowany jako rozpuszczalny substrat alkalicznej fosfatazy. Wyniki przedstawiono jako log2 miano Ab plus lub minus SE. CNBr oczyszczanie specyficznych dla FasL Ab. Rekombinowana szczurza FasL (5 mg) była związana z kolumną sefarozową aktywowaną CNBr zgodnie z instrukcjami producenta (17-0820-01; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA). Frazy specyficzne dla FasL z surowic (frakcja IgG) szczurów szczepionych DNA naniesiono na kolumnę, a następnie eluowano kwaśnym buforem do wymywania (glicyna, pH 2,5). Określenie izotypu oczyszczonego Ab (ELISA) ujawniło, że oczyszczone Aby są głównie izotypem IgG2a (dane nie pokazane). Analiza Western blot. Błony osocza uzyskano ze świeżo wyizolowanych lub 24-godzinnych aktywowanych komórek śledziony, jak opisano w innym miejscu (27). Białka rozdzielano następnie przez SDS-PAGE w warunkach redukujących i poddawano analizie Western blot zgodnie z protokołem opisanym szczegółowo w innym miejscu (28) z niewielką modyfikacją z użyciem 12% (zamiast 8%) bieżącego żelu. Oczyszczone CNBr przeciwciało anty-FasL wytwarzane przez nagie szczepienie DNA, IgG z normalnej surowicy szczurzej (końcowe stężenie po 10 | ag / ml każda) i komercyjnie dostępny mAb specyficzny wobec FasL (szczurzy klon przeciw-myszy / szczura H11, 804- 010-c100, przy końcowym stężeniu 1: 10 000, Alexis Biochemicals, San Diego California, USA) zastosowano jako pierwszorzędowe Ab. Izotyp szczurzego IgG2a dominuje w miano Ab u szczurów szczepionych DNA (dane nie pokazane), podobnie jak klon H11. W drugim etapie użyto kozie anty-szczurzy skoniugowany z fosforanem alkalicznym Ab (Sigma Chemical Co.). BCIP (0,15 mg / ml, Sigma Chemical Co.) i nitro-niebieski tetrazol (0,3 mg / ml, Sigma Chemical Co.) zastosowano jako substrat. Analiza FACS. Komórki przemyto raz w buforze FACS (PBS, 0,25% BSA, 0,05% azydek sodu), a następnie inkubowano przez 0,5 godziny w buforze FACS wzbogaconym 1% normalnej surowicy szczurzej. Następnie komórki zawiesza się ponownie (4 ° C, 0,5 godziny) na 96-studzienkowych płytkach U (106 / studzienkę) z 10. L buforu FACS uzupełnionego 0,5. G / ml albo swoistego anty-FasL Ab. -nieszczepione szczury (oczyszczone CNBr IgG, jak opisano powyżej) lub normalne szczurzy IgG
[podobne: wyparzanie słoików w piekarniku, klinika bocian białystok, komornik beata rusin ]
[przypisy: vegamedica, helides cena, kromed grybów ]