Docelowa szczepionka DNA kodująca ligand Fas określa podwójną rolę w regulacji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia ad 5

Przeprowadzono analizę cytometrii przepływowej w celu zweryfikowania kompetencji powyższych powyżej Ab do wiązania FasL na aktywowanych MBP komórkach T z naszej encefalitogennej linii komórek T (Figura 2c) i makrofagów otrzewnowych wywoływanych przez tioglikolan, które były aktywowane in vitro przez LPS (Figura 2d). ). Zgodnie z analizą Western blot, te swoiste dla siebie Aby głęboko wiążą aktywowane komórki obu typów. Tak więc, swoiste dla osobników Ab wytworzone na szczurach zaszczepionych DNA nie tylko wiążą rekombinowaną FasL, do której były immunizowane (Figura 2a), ale także jej naturalną, związaną z błoną postać (Figura 2, bd). Następnie oceniliśmy charakterystykę in vivo i in vitro tych Ab. Betyny specyficzne wobec FasL wytworzone u szczurów EAE zaszczepionych DNA znacząco zmniejszają TNF-a. produkcja podczas pierwotnej odpowiedzi swoistej dla antygenu. Dodanie swoistych przeciwciał FasL do swoistych wobec MBP (p68 <86) hodowanych komórek śledziony doprowadziło do wyraźnego zmniejszenia TNF-a. produkcji (rys. 3a, P <0,001), ale nie do produkcji ani IFN-y (Figura 3b), IL-4 (Figura 3c) lub IL-10 (nie pokazano). Dodanie tych Ab do hodowanych komórek śledziony nie miało znaczącego wpływu na odpowiedzi proliferacyjne komórek T specyficzne względem antygenu (Figura 3d, SI = 3,45 vs. 3,6). Wyniki te są godne uwagi, ponieważ nasze specyficzne dla FasL przeciwciała z AB wykazują bardzo niską reaktywność krzyżową na TNF-a. (Figura 3e, miano log2 Ab równe 24 w stosunku do 4, P <0,0001). Podczas odpowiedzi odpornościowej swoistej dla antygenu, TNF-a jest wytwarzany nie tylko przez aktywowane komórki T, ale także przez makrofagi. Aby wyjaśnić bezpośredni wpływ swoistych dla FasL przeciwciał na TNF-a wytwarzanie przez makrofagi aktywowane, makrofagi otrzewnowe wywołane tioglikolanem aktywowano (in vitro) za pomocą LPS, z dodatkiem lub bez kontrolnej IgG od naiwnych szczurów Lewisa lub z oczyszczonymi Ab (Fig. 4). Dopiero dodanie specyficznych dla FasL Ab prowadziło do znacznego zmniejszenia TNF-a. wytwarzanie przez te komórki (Figura 4, 990. 48 w stosunku do 720. 40 pg / ml, z tłem odpowiednio 620. 34 i 630. 42 pg / mL, P <0,01). Te Aby nie wpłynęły na żywotność hodowanych makrofagów (co określono na podstawie poboru błękitem trypanowym). Zatem redukcja TNF-a produkcja w obecności przeciwciał Ab specyficznych dla FasL nie może być wyjaśniona przez możliwą utratę żywotności makrofagów. Aby określić, czy powyższe obniżenie można przypisać bezpośredniemu wpływowi na transkrypcję mRNA swoistego dla TNF-a, powtórzono doświadczenie opisane powyżej (Figura 4a) i poziomy mRNA kodującego TNF-a. lub IL-18 zostały określone, jak opisujemy szczegółowo w innym miejscu (13, 29). Wydaje się, że hodowane makrofagi wykazują wyraźną redukcję TNF-a, ale nie w transkrypcji mRNA IL-18 (Figura 4b). To może wyjaśniać znaczącą redukcję TNF-a produkcja w tych komórkach (Figura 4a) i prawdopodobnie w pierwotnych hodowanych komórkach śledziony (Figura 3a). Podobne wyniki uzyskano również stosując dostępny w handlu Ab (klon H11; Alexis Biochemicals). Nie jest jeszcze jasne, czy wiązanie rozpuszczalnego FasL z jego receptorem wzmaga TNF-a. transkrypcja mRNA lub dokowanie FasL związanego z błoną przez anty-FasL Ab inicjuje kaskadę transdukcji sygnału prowadzącą do zmniejszenia TNF-a. transkrypcja mRNA. Fig. 3: Abrobiny specyficzne dla FasL wytworzone u szczurów szczepionych DNA znacznie zmniejszają TNF-a. produkcja podczas pierwotnej odpowiedzi swoistej dla antygenu. Komórki śledziony z primowanych p68-86 / CFA (dzień 9) szczurów Lewisa hodowano z dodatkiem lub bez 100. M MBP p68-86. Hodowane komórki otrzymywały 100 ng / ml specyficznego dla FasL Ab (IgG z surowicy szczurów EAE szczepionych FasLa. [Figura 1, dzień 13] oczyszczonych na kolumnie z aktywowanym FasL CNBr3 Sepharose) lub kontrolnej IgG od naiwnych szczurów, jak wskazano . Po 72 godzinach stymulacji TNF-a (a), IFN-y (b) i określono IL-4 (c). Wpływ tych przeciwciał na pierwotną odpowiedź komórek T na 100 .M MBP p68-86 (d) określono za pomocą testu proliferacji in vitro. Specyficzność antygenową tych Ab (e) określono za pomocą bezpośredniego testu ELISA. Rekombinowany ligand Fas, który wytworzyliśmy, lub dostępny w handlu TNF-a. naniesiono na 96-studzienkowe płytki ELISA w stężeniach 50 ng / studzienkę. Przeciwciała przeciwko szczurzej, w seryjnych rozcieńczeniach od 28 do 230, dodano do płytek ELISA. Kozy anty-szczurzy IgG sprzężone z fosfatazą alkaliczną zastosowano jako znakowane Ab i p-NPP zastosowano jako rozpuszczalny substrat alkalicznej fosfatazy. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech powtórzeń. SE. AP <0,001. Fig. 4 Abs swoiste dla Fla wytworzone u szczurów zaszczepionych DNA znacząco zmniejszają TNF-a. transkrypcja i produkcja w makrofagach aktywowanych LPS. Makrofagi otrzewnowe wywołane przez tioglikolan były aktywowane (in vitro) przez LPS, z lub bez dodania całkowitej IgG od naiwnego szczura lub oczyszczone Ab (specyficzne dla FasL) otrzymane jak opisano w legendzie do Figury 3 [patrz też: beata rusin komornik, sanatorium krystyna busko, mąka ziemniaczana jako puder ] [patrz też: duszacy kaszel, mazak gostyń, protruzja krążka ]