CD44 jest miejscem wiązania makrofagów dla Mycobacterium tuberculosis, które pośredniczy w rekrutacji makrofagów i ochronnej odporności przeciwko gruźlicy cd

Granulocyte i M. skrawki następnie inkubowano w 10% normalnej surowicy koziej (DAKO A / S) i eksponowano, odpowiednio, na znakowane FITC przeciwciało mAb anty-mysie Ly-6G (Pharmingen) lub szczurzym przeciw mysiemu mAb F4 / 80 IgG2b (Serotec Ltd., Oxford, Wielka Brytania). W celu barwienia granulocytów, szkiełka inkubowano z króliczym anty-FITC Ab (DAKO A / S), a następnie dalej inkubowano z biotynylowanym świńskim anty-króliczym Ab (DAKO A / S). Formularz. barwienie, szkiełka inkubowano z kozim anty-szczurzym-HRP (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA). Skrawki ostatecznie inkubowano w roztworze streptawidyny-ABC (DAKO A / S) i opracowano stosując 1% H2O2 i DAB (Sigma-Aldrich) w Tris-HCl. Preparaty wybarwiano kontrastowo hematoksyliną i oceniano przez patologa zaślepionego na genotyp zwierząt. Pobudzenie splenocytów. Otrzymaliśmy zawiesiny pojedynczych komórek przez zmiażdżenie śledzion przez 40-.m filtr sitowy (Becton Dickinson and Co.). Erytrocyty poddano lizie z lodowatym izotonicznym roztworem NH4Cl (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 100 mM EDTA [pH 7,4]), a pozostałe komórki przemyto dwukrotnie RPMI 1640 (BioWhittaker Europe, Verviers, Belgia). W celu oceny odpowiedzi immunologicznych swoistych dla antygenu, komórki zawieszono w pożywce (RPMI 1640, 10% FCS, 1% antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy [GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA]), wysiane w 96-dołkowych okrągłych komórkach. osadzone płytki hodowlane o gęstości komórek równej x 106 komórek na studzienkę w trzech powtórzeniach i stymulowane 20 .g / ml oczyszczonej białka pochodnej tuberkuliny (PPD, Statens Seruminstitut, Kopenhaga, Dania). Do stymulacji splenocytów niezakażonych CD44 + / + i CD44a /. myszy, komórki stymulowano 10 | ag / ml enterotoksyny gronkowcowej B (SEB, Sigma-Aldrich), 7 | ag / ml enterotoksyny gronkowcowej A (SEA, Sigma-Aldrich) lub powleczonej anty-CD3 (klon 145-2C11; ) i .g / ml przeciwciała anty-CD28 (klon 37.51; Pharmingen) Ab. Supernatanty zebrano po 48-godzinnej inkubacji w 37 ° C w 5% CO2 i poziomy cytokin analizowano za pomocą testu ELISA. CD44 + / + i CD44. /. M. stymulacja. Wyizolowaliśmy M. S z CD44 + / + i CD44. /. myszy przez przemycie jamy otrzewnej za pomocą RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS. Zebrane komórki pozostawiono do przylgnięcia do 96-studzienkowych płytek do hodowli tkankowej (105 komórek na studzienkę) przez godzinę w 37 ° C, po czym nieprzylegające komórki usunięto przez płukanie monowarstwy komórek medium. Ponad 95% komórek stanowiły Ms, zidentyfikowane przez preparaty cytospinowe barwione zmodyfikowanym barwnikiem Giemsy. M. monowarstwy zakażono M. tuberculosis w RPMI 1640 i 10% FCS w bakterii / M. stosunek (MOI) 10, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37 ° C; następnie supernatanty odessano i poziomy cytokin analizowano za pomocą testu ELISA. Pomiary cytokin. IFN-a, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a i M. białko zapalne-1. (MIP-1 a) mierzono w homogenatach płuc, supernatantach komórek śledziony i M. supernatanty za pomocą specyficznych testów ELISA przy użyciu dopasowanych par Ab zgodnie z instrukcjami producenta (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). Wiązanie i fagocytoza M. tuberculosis przez CD44 + / + i CD44. /. M. S. M. S zostały wyizolowane z CD44 + / + i CD44. /. myszy, jak opisano powyżej. Wiązanie i fagocytoza M. tuberculosis zostały określone jak opisano wcześniej (23, 27). Krótko, M. monowarstwy (105 komórek na studzienkę) zakażono M. tuberculosis w RPMI 1640 i 10% FCS przy MOI wynoszącym 10, a następnie inkubowano przez 2 godziny w 37 ° C, po czym supernatanty odessano. Każdą studzienkę przemyto trzykrotnie RPMI 1640 i 10% FCS w celu usunięcia pozostałych nieprzylegających prątków. W celu oceny obciążenia mikobakteriami, komórki pozostające przyłączone do studzienek do hodowli tkankowej inkubowano sterylnie destylowaną H2O z 0,1% soli sodowej siarczanu dodecylu (Merck KGaA) przez 10 minut w 25 ° C. Po seryjnym dziesięciokrotnym rozcieńczeniu lizatu komórkowego, liczbę prątków, które były związane z Ms określono przez naniesienie na Middlebrook 7H11, a CFU wyliczono po 21 dniach. Aby ocenić, czy pałeczki były fagocytowane, infekowaliśmy Ms przez 2 i 17 godzin przy MOI 2, po czym komórki przemywano trzy razy PBS, utrwalano 2% paraformaldehydem i usuwano z płytki. Wytworzono cytospiny, wybarwiono barwnikiem Ziehl-Neelsena dla pałeczek kwasoopornych i wybarwiono kontrastowo 0,1% błękitu metylenowego. Co najmniej 100. 200 komórek zliczono na każdej cytospinie. Liczba wewnątrzkomórkowych prątków w każdym M. został policzony. Żywotność komórek M. hodowle oceniano z podwójnych studzienek za pomocą wykluczenia błękitem trypanu i wydawały się podobne (> 95%) w obu grupach. Wiązanie CD44 z M. tuberculosis. Bakterie H37Rv M. tuberculosis (2 x 105) inkubowano przez 30 minut w 37 ° C z ng ludzkim rozpuszczalnym białkiem CD44 (białko CD44std) (Bender MedSystems, Wiedeń, Austria) lub z rozcieńczalnikiem w oktuplikacie.
[więcej w: sanatorium krystyna busko, zapalenie trzustki u kota, remigiusz wierzgoń wikipedia ]
[więcej w: raven market, engerix b cena, remigiusz wierzgoń wikipedia ]