CD44 jest miejscem wiązania makrofagów dla Mycobacterium tuberculosis, które pośredniczy w rekrutacji makrofagów i ochronnej odporności przeciwko gruźlicy ad

Specjalne wolne od patogenu 8- do 10-tygodniowe samce i samice myszy z niedoborem CD44 (CD44 | /.) Na tle C57BL / 6 (24) stanowiły miły dar dla A. Berns (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, The Holandia). Badanie podzbiorów limfocytów w śledzionie i węzłach chłonnych CD44. /. myszy wykazywały prawidłową dystrybucję i liczbę limfocytów T CD4 + i CD8 + (24). Myszy C57BL / 6 typu dzikiego (CD44 + / +) zakupiono od Iffa Credo (L. Arbresle, Francja). Zwierzęta utrzymywano w urządzeniach poziomu 3 bezpieczeństwa biologicznego. We wszystkich eksperymentach stosowano kontrole dopasowane do płci i wieku. Komitet ds. Opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania na Uniwersytecie w Amsterdamie zatwierdził wszystkie eksperymenty. Eksperymentalna infekcja. Zjadliwy laboratoryjny szczep M. tuberculosis H37Rv (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) hodowano przez 4 dni w płynnej pożywce Dubos (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) uzupełnionej 0,5% BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) i 0,01% Tween-80. Replikowaną hodowlę inkubowano w temperaturze 37 ° C, zbierano w fazie logarytmicznej i przechowywano w porcjach w temperaturze <70 ° C. W każdym doświadczeniu ampułkę rozmrożono i przemyto dwukrotnie sterylnym 0,9% NaCl. Gruźlica została wywołana, jak opisano wcześniej (25, 26). Pokrótce, myszy znieczulono przez inhalację izofluranem (Abbott Laboratories Ltd., Kent, Wielka Brytania) i zakażono donosowo x 105 żywych prątków H37Rv M. tuberculosis w 50 .l soli fizjologicznej, jak określono przez żywe liczenie na Middlebrook 7H11 (Difco, Detroit, Michigan, USA) płytki agarowe. Liczby bakterii odzyskane z płuc dzień po infekcji (pi) pokazano wcześniej jako podobne do liczby bakterii w inokulum (26). Różnicowanie komórek płuc. Zawiesinę komórek płucnych uzyskano stosując zautomatyzowane urządzenie do dezagregacji (Medimachine System, DAKO A / S, Glostrup, Dania) i ponownie zawieszono w pożywce. Erytrocyty poddano lizie z lodowatym izotonicznym roztworem NH4Cl, a pozostałe komórki przemyto dwukrotnie RPMI. Całkowite leukocyty w zawiesinach komórek płucnych zliczano za pomocą hemacytometru i roztworu Turka (Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy). Procenty Ms, PMN i limfocytów określono za pomocą preparatów cytospinowych barwionych zmodyfikowaną barwą Giemsy (Diff-Quik; Baxter Healthcare Corp., McGraw Perk, Illinois, USA). Analiza FACS. Zawiesiny komórek płucnych otrzymane od zainfekowanych myszy analizowano za pomocą FACS (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA), jak opisano wcześniej (26). Komórki doprowadzono do stężenia 4 x 106 komórek / ml buforu FACS (PBS uzupełniony 0,5% BSA, 0,01% NaN3 i 100 mM EDTA). Barwienie immunologiczne dla cząsteczek powierzchni komórki przeprowadzono przez 30 minut w temperaturze 4 ° C, stosując bezpośrednio znakowane Abal wobec CD3 (CD3-fikoerytryna), CD4 (CD4-CyChrome) i CD8 (białko chlorofilowe CD8-FITC i CD8-perydynowe). Wszystkie Ab były stosowane w stężeniach zalecanych przez producenta (Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA). Aby skorygować niespecyficzne wybarwienie, zastosowano odpowiedni kontrolny Ab (szczurzy IgG2, Pharmingen). Komórki utrwalono 2% paraformaldehydem, a cząsteczki powierzchni analizowano przez bramkowanie populacji CD3 +. Liczbę pozytywnych komórek uzyskano przez ustawienie kwadrantowego markera do nieswoistego barwienia. Histologia i immunohistochemia. Płuca usunięto 2 lub 5 tygodni po inokulacji M. tuberculosis, utrwalono przez 24 godziny w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 24 godziny i zatopiono w parafinie. W doświadczeniu z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH), stopy zostały usunięte z myszy prowokowanych antygenem po immunizacji zabitym ciepłem M. tuberculosis. Po utrwaleniu formaliny próbki odwapniono w kwasie mrówkowym i zatopiono w parafinie. Skrawki wybarwione H & E kodowano i oceniano półilościowo dla nacieków zapalnych i tworzenia ziarniniaka płuc przez patologa. Obecność komórek CD44 +, granulocytów i Ms wykazano za pomocą immunohistochemii. Szkiełka poddano deparafinizacji, a endogenną aktywność peroksydazy zahartowano roztworem metanolu z 0,03% H2O2. W celu barwienia CD44, szkiełka następnie traktowano 10 mM roztworem cytrynianu sodu (pH 6,0) przez 10 minut w temperaturze 98 ° C w piecu mikrofalowym, inkubowano ze szczurzym anty-mysim CD44 IgGl (KM114; Pharmingen), a następnie dalej inkubowano z króliczym anty-szczurzy-biotyna (DAKO A / S) i roztwór streptawidyna-ABC (DAKO A / S). Do opracowania barwy użyto 1% H202 i tafachlorku 3,3-di-aminobenzydyny (DAB, Sigma-Aldrich) w Tris-HCl. Skrawki umieszczono w żelatynie glicerynowej bez barwienia kontrastowego i analizowano. W celu barwienia granulocytów, szkiełka trawiono roztworem 0,25% pepsyny (Sigma-Aldrich) w 0,01 M HCl; Formularz. barwienie, szkiełka trawiono 0,1% trypsyną (Sigma-Aldrich) [więcej w: mazakzabawki, klinika bocian białystok, komornik sądowy beata rusin ] [patrz też: hydrokolonoterapia warszawa, hydrokolonoterapia poznań, hydrokolonoterapia wrocław ]